lọc bằng phản ứng PCR.
Dựa trên số lượng cây T1 dương tính với sự có mặt của gen đích qua kết quả PCR, thử nghiệm chi bình phương được sử dụng để xác định tỷ lệ phân ly phù hợp cho mỗi dòng T1. Có thể nhận thấy, trong 6 dòng cây T1 được khảo sát, bốn tập hợp có tỷ lệ phân ly bất thường (Bảng 3.2). Điều này có thể là do các cây T1 được khảo sát có số lượng thấp và không mang tính đại diện cho quần thể. Nguyên nhân là do hạt T1 có khả năng nảy mầm không cao và không đồng đều. Trong khi đó, hai dòng D5 và D14 phân ly phù hợp với tỷ lệ 3:1. Điều này cho thấy gen chuyển được sát nhập vào hệ gen của cây ngô T0 tại một vị trí duy nhất (một locus), các gen được di truyền cho các cây ở thế hệ kế tiếp theo định luật phân ly của Mendel (Bảng 3.2).
3.3.4. Ước lượng số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T1 T1
Từ kết quả sàng lọc bằng PCR và phân tích quy luật phân ly của gen
ZmDREB2.7tv trong thế hệ T1, hai dòng D5 và D14 được cho là có mang gen chuyển tại một locus nhất định trong hệ gen. Để khảo sát và kiểm chứng kĩ hơn, số bản sao của gen ZmDREB2.7tv được ước lượng bằng phương pháp real-time PCR định lượng trên 6 cây T1 dương tính của dòng D5.
Đường chuẩn của mỗi gen được xây dựng dựa theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.10 với các thông số được liệt kê ở bảng 3.3. Các chỉ số của hai đường chuẩn đều cho kết quả chấp nhận được. Từ các thông số của đường chuẩn (Bảng 3.3) và giá trị chu kì ngưỡng trung bình của mỗi mẫu thí nghiệm (Bảng 3.4), tỷ lệ Z0/G0 được tính toán dựa trên công thức {1} (Mục 2.2.10 phần phương pháp).
Bảng 3.3. Đường chuẩn khuếch đại của hai gen ZmDREB2.7tv và Glb-1 Thông số ZmDREB2.7tv Glb-1 Hệ số góc (S) -3,47 -3,95 Hiệu suất phản ứng 1,94 1,79 Error 0,27 0,9 Hệ số tương đương (R2) 0,99 0,94
Số chu kì bão hòa (Y-intercept (I) 20,3 24,81
Glb-1 là một gen quản gia (house-keeping gene) trong cây, mã hóa cho protein globulin-1 và được kiểm tra trên cơ sở dữ liệu maizegdb.org là có một bản sao trong cây ngô. Do đó, gen Glb-1 được sử dụng để làm gen nội chuẩn cho thí nghiệm. Cặp mồi nhân đặc hiệu đoạn gen Glb-1 được thiết kế và kiểm tra bằng công cụ primer-BLAST để đảm bảo không khuếch đại các đoạn không đặc hiệu trong cây ngô và có thể dẫn đến kết quả ước lượng sai. Cặp mồi nhân đoạn gen
ZmDREB2.7tv gồm mồi ngược nhận biết vị trí trong gen và mồi xuôi nhận biết vị trí trên promoter rd29A. Điều này giúp phản ứng real-time PCR không khuếch đại gen
ZmDREB2.7 nội sinh trong cây ngô K7 và ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm. Do dòng nền K7 được sử dụng trong thí nghiệm chuyển gen là dòng thuần, gen Glb-1
được coi là nằm trên một locus và ở trạng thái đồng hợp, tức mang hai bản sao của gen này trong hệ gen của cây chuyển gen. Như vậy, từ tỷ lệ Z0/G0 có thể ước lượng được số bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T1.
Bảng 3.4. Giá trị Ct và số lượng bản sao gen ZmDREB2.7tv của trong các cây chuyển gen thế hệ T1
Cây T1
Giá trị CtZ trung bình Z0/G0 Số bản sao gen
ZmDREB2.7tv ZmDREB2.7tv Glb-1 D5.1 31,60 36,07 0,39 1 D5.4 31,25 36,09 0,50 1 D5.5 31,68 36,34 0,44 1 D5.8 30,33 36,4 1,11 2 D5.9 30,75 35,61 0,53 1 D5.10 34,53 39,71 0,47 1
Trong số 6 cây T1 dương tính với sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv, 5 cây mang một bản sao của gen ZmDREB2.7tv, điều đó có thể được hiểu rằng gen
ZmDREB2.7tv đã sát nhập tại một vị trí trong hệ gen và ở trạng thái dị hợp (Bảng 3.4). Cây T1 còn lại - D5.8 cho tỷ lệ Z0/G0 xấp xỉ bằng 1 nên được cho có hai bản sao của gen ZmDREB2.7tv. Với kết quả phân tích phân ly ở mục 3.3.4 và kết quả real-time PCR định lượng của các cây T1 nói trên, có thể cho rằng cây T1 D5.8 mang gen ZmDREB2.7tv tại một locus trong hệ gen và ở trạng thái đồng hợp tử.