Trong nghiên cứu này, RNA được tách chiết theo phương pháp sử dụng TRI Reagent có cải tiến phù hợp với mẫu lá ngô. Đầu tiên, 2 - 3 g lá được nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ. Sau đó, bổ sung ngay 700 µL Trizol và bột lá và trộn đều. Hỗn hợp mẫu được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Tiếp theo, ống mẫu được ly tâm ở điều kiện 12.000 vòng/phút, trong 10 phút ở 4°C, sau đó thu dịch ở pha trên và chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. 300 µL Chloroform được bổ sung vào ống và vortex trong 15 – 20 giây. Ống mẫu được ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và dịch trên được chuyển sang ống ly tâm 1,5 mL mới. RNA được tủa bằng cách bổ sung 300 µL 2-propanol lạnh và ủ mẫu ở -20°C trong 1giờ. Sau đó, ống mẫu được ly tâm với điều kiện 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Tủa RNA được rửa bằng cách bổ sung 300 µL EtOH 70%, lắc nhẹ ống và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C và loại bỏ dịch. Bước rửa tủa được thực hiện hai lần. Tủa RNA được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút sau đó hòa tan RNA tổng số trong 50 µL nước đã được xử lý với DEPC (Diethyl pyrocarbonate). RNA tổng số được bảo quản ở -80°C.
RNA được kiểm tra nồng độ bằng máy đo quang phổ và đưa về nồng độ 1 µg/µL để làm khuôn cho phản ứng tổng hợp sợi thứ nhất. Phản ứng tổng hợp cDNA sử dụng bộ kit USB® First-Strand cDNA Synthesis Kit for Real-Time PCR
(Affymetrix, Mỹ). Quy trình thao tác được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.3. Phương pháp PCR
Phản ứng PCR được tiến hành với thể tích là 25 µL. Bao gồm các thành phần: 2,5 µL 10X DreamTaq Buffer, 1 µL dNTPs 10mM, 1 µL 10 µM mồi xuôi, 1 µL 10 µM mồi ngược, 1 µL DNA khuôn (20 ng – 100 ng), 0,2 µL 5U/µL DreamTaq DNA polymerase và nước. Phản ứng được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Master Cycler Pro S với chu trình nhiệt như sau:
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 45 giây, 58°C - 45 giây, 72°C - 1 phút 30 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 1 phút; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân vùng rd29A::ZmDREB2.7tv: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 56°C - 30 giây, 72°C - 1 phút 15 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
- Chu trình nhiệt với phản ứng PCR nhân gen HygR: 95°C - 3 phút; 30 chu kỳ: 95°C - 30 giây, 54°C - 30 giây, 72°C - 50 giây; 72°C - 5 phút; 4°C.
2.2.4. Tinh sạch DNA
- Sản phẩm PCR và sản phẩm cắt với enzyme giới hạn được tinh sạch bằng bộ kit GeneJET Gel Purification Kit (Thermo Scientific,Mỹ).