chuyển gen
Phương pháp định lượng tương đối [29] gồm hai phân tích định lượng tuyệt đối được sử dụng để ước lượng số bản sao của gen quan tâm trong cây chuyển gen. Hai phân tích định lượng tuyệt đối được thực hiện trên đoạn rd29A:ZmDREB2.7tv
và gen đối chứng nội sinh globulin-1 (Glb-1 - là gen đơn bản trong cây ngô).
Phản ứng real-time PCR định lượng sử dụng Luna® Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Mỹ) trên hệ thống máy LightCycler® 96 System (Roche, Thụy Sĩ). Mỗi phản ứng có thể tích 20 µL gồm các thành phần: 10 µL Luna Universal qPCR Master Mix, 0,5 µL 10 µM mồi xuôi, 0,5 µL 10 µM mồi ngược, 1 µL 10 ng DNA tổng số và nước. Cặp mồi nhân vùng rd29A: :ZmDREB2.7tv là grd29A_F và gZm2.7_R. Cặp mồi nhân gen nội sinh Glb-1 là qGlb1_F và qGlb_R. Chu trình nhiệt cho phản ứng như sau: 95°C - 60 giây; 45 chu kỳ: 95°C - 15 giây, 60°C - 30 giây. Điều kiện để phân tích đường cong nóng chảy được sử dụng chương trình mặc định của hệ thống máy.
Đường chuẩn được xây dựng bằng cách pha loãng DNA tổng số của cây chuyển gen D5.1 về nồng độ 1 ng/µL, 10 ng/µL và 100 ng/µL và sử dụng để làm khuôn cho phản ứng real-time PCR. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại ba lần. Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm LightCycler® 96 version 1.1 và xây dựng đường chuẩn cho mỗi trình tự rd29A::ZmDREB2.7tv và Glb-1.
Khi đó, số lượng bản sao của gen ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen được suy ra tương đối từ tỷ lệ giữa số lượng phân tử ban đầu của trình tự
rd29A::ZmDREB2.7tv với Glb-1 trong hệ gen cây ngô (Z0/G0) theo công thức: {1}
Trong đó, Z và G lần lượt là ký hiệu gen ZmDREB2.7tv và Glb-1; I và S lần lượt là chu kì bão hòa (Y-intercept) và hệ số góc (slope) của đường chuẩn, Ct là giá