chứng minh là có khả năng nhận gen ngoại lai tốt. Thí nghiệm chuyển gen với 3037 phôi non thông qua vi khuẩn A. tumefaciens chủng EHA105 mang vector chuyển gen thực vật pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7tv được tiến hành trong ba lần thí nghiệm (Bảng 3.1). Thời gian từ lúc lây nhiễm phôi đến khi chuyển cây ra nhà lưới ở ba lần chuyển gen khác nhau, tuy nhiên đều kéo dài trong khoảng ba tháng. Qua các giai đoạn khác nhau, phôi được chuyển sang các môi trường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng và kháng sinh chọn lọc phù hợp (Bảng 2.2). Số lượng phôi sau khi nuôi cấy trên các môi trường giảm dần theo thí nghiệm chuyển gen và tái sinh cây chuyển gen (Hình 3.11; Bảng 3.1).
Hình 3.11. Quá trình chuyển gen vào ngô trung gian qua vi khuẩn Agrobacterium.
A. Các phôi chưa non trên môi trường đồng nuôi cấy sau khi lây nhiễm với vi khuẩn A.
tumefaciens EHA105 mang vector pCAMBIA1300/rd29A:ZmDREB2.7tv. B. Các phôi ngô trương lên và bắt đầu tạo mô sẹo sau khi đặt trên môi trường phục hồi, 10 ngày sau lây nhiễm. C và D. Môi sẹo đang phôi hóa ở môi trường chọn lọc I và II, 24 và 38 ngày sau lây
nhiễm. E và F. Các chồi hình thành từ mô sẹo trong môi trường tái sinh I và II, 48 và 62 ngày sau lây nhiễm. G. Cây con tái sinh trong môi trường ra rễ, 84 ngày sau lây nhiễm
.
Phôi non từ các bắp ngô sau khi thụ phấn 9-13 ngày (thời gian thay đổi dựa theo mùa vụ) sẽ được tách trong điều kiện vô trùng. Các phôi được lựa chọn có màu vàng sáng, có đường kính khoảng 1,0 - 1,2 mm. Các phôi quá non dễ chết và khó tái sinh trong quá trình nuôi cấy mô. Trong khi đó, các phôi quá già khó nhận gen
chuyển và do đó cũng nhanh bị loại bỏ trong quá trình chuyển gen. Trong quá trình lấy phôi khỏi hạt, các thao tác có thể tạo ra nhiều vết cắt nhỏ, đây là các vị trí để vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập và chuyển T-DNA vào tế bào. Tuy nhiên, nếu vết cắt ảnh hưởng đến vùng lá mầm trong phôi, quá trình mô sẹo hóa của phôi sẽ thấp. Phôi sau khi lấy khỏi bắp được giữ ẩm trong môi trường đồng nuôi cấy không có vi khuẩn trước khi lây nhiễm. Thời gian phôi lây nhiễm với vi khuẩn trong môi trường lỏng, mật độ của vi khuẩn cũng như nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng xâm nhập của vi khuẩn. Tuy nhiên, nghiên cứu này không tiến hành tối ưu các điều kiện mà sử dụng điều kiện nhóm tác giả Frame và cộng sự đã công bố cho phôi non của dòng nền Hi-II [14].
Các phôi sau đó tiếp tục được đồng nuôi cấy với vi khuẩn trên môi trường thạch trong tối, trong 3 ngày ở 21°C (Hình 3.11A). Trong giai đoạn này, vi khuẩn tiến hành chuyển T-DNA vào trong tế bào và sát nhập cấu trúc chuyển gen vào hệ gen nhân của cây. Nhiệt độ 21°C làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn do vi khuẩn A. tumefaciens sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28°C. Trong hai đợt chuyển gen đầu tiên, số lượng phôi sau giai đoạn này giữ nguyên. Tuy nhiên, ở đợt chuyển gen thứ 3, khoảng 1/3 số phôi bị chết. Nguyên nhân là do phôi non được thu trong vụ thu đông có nhiệt độ thấp và độ dài ngày ngắn; do đó, dù sau thụ phấn 12 ngày, phôi vẫn chưa đạt được độ trưởng thành như ở vụ xuân hè. Các phôi bị chết trong đợt chuyển gen ở giai đoạn đồng nuôi cấy là các phôi có kích thước bé và non. Phôi chết sẽ có màu trắng ngà, cấu trúc mềm và dễ bị vỡ. Trong khi đó, các phôi sống sót sau giai đoạn hút nước và trương lên, cấu trúc phôi rắn hơn so với thời điểm thu phôi non.
Khi chuyển sang môi trường nuôi cấy phục hồi (Hình 3.11B), chỉ có phôi ngô mới có thể sống sót và sinh trưởng do môi trường có chứa kháng sinh kháng khuẩn mạnh (cefotaxim 100mg/L và vancomycin 100mg/L). Sau 7 ngày nuôi cấy, vi khuẩn Agrobacterium bị loại hoàn toàn khỏi mẫu nuôi cấy. Đồng thời, phôi sau giai đoạn này có sự thay đổi về kích thước và cấu trúc phôi. Phần lá mầm và rễ
phôi chuyển sang dạng mô sẹo. Phôi rắn và bắt đầu có dấu hiệu mô sẹo hóa. Một số lượng đáng kể phôi bị bỏ đi trong bước này (đợt 1 - 29,8%, đợt 2 - 28,8%, đợt 3 - 11,1%, trung bình - 25,1%).
Giai đoạn chọn lọc và tạo mô sẹo được xảy ra đồng thời khi phôi được chuyển sang môi trường chọn lọc 1 và chọn lọc 2 (Hình 3.11C, D). Môi trường chọn lọc được bổ sung kháng sinh hygromycin. Đây là một aminoglycoside gây chết vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân thực bằng cách ức chế tổng hợp protein. Hygromycin B đã được sử dụng như là một nhân tố chọn lọc hiệu quả trong các nghiên cứu chuyển gen thực vật và nhiều hệ vector chuyển gen sử dụng kháng sinh này. Do trong cấu trúc của T-DNA mang gen ZmDREB2.7tv, có thêm cấu trúc biểu hiện của gen kháng kháng sinh hygromycin - HygR, nên các phôi được lây nhiễm mới có khả năng sống sót. Sau 4 tuần nuôi cấy, phôi được mô sẹo hóa hoàn toàn với đặc điểm có màu trắng sáng, cấu trúc chắc chắn và đặc trưng (Hình 3.11C, D). Các phôi không mang gen chuyển sẽ chuyển dạng mềm, màu sẫm và đen. Số lượng phôi sống sót trung bình đạt 13,7% trên tổng số phôi sau giai đoạn nuôi phục hồi.
Các phôi được giữ lại sẽ chuyển sang môi trường tái sinh 1 và 2 để tạo thành cây con (Hình 3.11E, F). Do môi trường tái sinh không có thành phần 2,4-D, các mô sẹo không được duy trì mà bắt đầu tạo chồi. Sau 1 tuần đặt trên môi trường tái sinh 1 trong tối, các mô sẹo được chuyển sang môi trường tái sinh 2 và đặt dưới ánh sáng. Môi trường tái sinh 2 không có kháng sinh chọn lọc và được bổ sung thêm nước dừa như là một nguồn chất kích thích sinh trưởng tự nhiên. Dưới ánh sáng, các cấu trúc màu xanh nhạt bắt đầu xuất hiện và phát triển dần thành các chồi nhỏ (trung bình 2-5 chồi/ mô sẹo) (Hình 3.11F). Các chồi bình thường sẽ được chuyển sang bình môi trường mới sau mỗi 1 tuần cho đến khi đạt kích thước đủ để chuyển sang môi trường ra rễ. Số phôi ở giai đoạn này giảm khoảng một nửa ở cả ba lần thí nghiệm. Nguyên nhân là do nhiều chồi phát sinh có hình thái không bình thường: lá cong, chồi ngắn, hình thái dị dạng. Hơn nữa, việc chuyển bình môi trường liên tiếp dễ gây tạp nhiễm do đó nhiều bình nuôi cấy mô bị loại do chứa nấm. Như vậy, tổng
của ba lần thí nghiệm, từ 280 mô sẹo, 127 chồi xuất hiện và được chuyển sang môi trường ra rễ.
Sau khoảng ba tuần ở môi trường ra rễ (Hình 3.11G), các cây tái sinh đủ khỏe mạnh được chuyển sang trồng trên giá thể trấu hun trong nhà lưới. Cây tái sinh được trồng trong điều kiện độ ẩm 80% bằng cách phun sương. Giai đoạn này giúp các rễ tái sinh khỏe mạnh và đủ cứng cáp để chuyển sang trồng trên đất trong nhà lưới. Kết quả thu được 91 cây tái sinh, tuy nhiên 15 cây bị chết do rễ bị hỏng khi trồng trên giá thể trấu.
Bảng 3.1. Kết quả chuyển gen ZmDREB2.7tv vào cây ngô
Môi trƣờng/Tiêu chí
Số lƣợng phôi trong thí nghiệm chuyển gen Đợt 1* Đợt 2* Đợt 3** Tổng cộng Đồng nuôi cấy 1037 1063 937 3037 Nuôi phục hồi 1037 1063 624 2724 Chọn lọc 1 728 757 555 2040 Chọn lọc 2 291 301 444 1036 Tái sinh 1 112 104 64 280 Tái sinh 2 112 104 33 249 Môi trường ra rễ 52 57 28 137 Nhà lưới sống sót 25 28 27 76 Cây T0 dương tính 7 8 15 30 Cây T0 tự thụ phấn 4 2 0 6
Như vậy, sau 3 đợt chuyển gen, từ 3037 phôi ban đầu đã tạo ra 76 cây chuyển gen T0 sống sót và trồng trong nhà lưới (Bảng 3.1). Các cây này được thu lá để tiến hành tách chiết DNA tổng số và đánh giá sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv.