Các cây tái sinh thế hệ T0 được đánh giá ở mức độ phân tử bằng thí nghiệm PCR. Ban đầu, lá của các cây này được thu và tách chiết DNA tổng số. Kết quả trình bày trên hình 3.12 cho thấy DNA đã được tách chiết từ các cây tái sinh thế hệ T0 mặc dù có một số đứt gãy nhưng vẫn đảm bảo chất lượng cho thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.12. Điện di đồ DNA tổng số tách từ các cây chuyển gen ZmDREB2.7tv thế hệ T0 1 - 12: DNA tổng số của cây chuyển gen tương ứng.
Để đánh giá sự có mặt của gen ZmDREB2.7tv, phản ứng PCR được thực hiện sử dụng cặp mồi nhân đoạn từ cuối promoter rd29A (rd29A_F) đến cuối gen (ZmDREB2.7_SacI_R). Do trong cây ngô có gen nội sinh ZmDREB2.7, việc sử dụng cặp mồi này tránh hiện tượng dương tính giả, nhờ vậy chỉ những cây mang cấu trúc rd29A::ZmDREB2.7tv mới cho băng sản phẩm PCR trên bản điện di. Kết quả PCR với DNA tổng số của cây WT cho thấy không cho băng sản phầm PCR nào với kích thước như lý thuyết (Hình 3.13). Điều này chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi hiệu quả trong việc sàng lọc cây chuyển gen. Trong khi đó, đối với một vài cây
chuyển gen T0 đã thu được sản phẩm PCR với kích thước mong muốn (Hình 3.13, đường chạy số 1 - 5, 9 - 11)
Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv trong cây chuyển gen thế hệ T0
M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). + : Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;1-14: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các
cây chuyển gen ZmDREB2.7tv tương ứng.
Đồng thời, bên cạnh việc xác định sự có mặt của gen quan tâm, sự có mặt của gen chỉ thị HygR trong cây chuyển gen cũng được kiểm tra bằng thí nghiệm PCR. Đôi khi, kể cả có mặt gen quan tâm, nhưng phản ứng PCR không khuếch đại được gây ra hiện tượng âm tính giả. Việc kiểm tra đồng thời sự có mặt của HygR
giúp đảm bảo chắc chắn thu được các cây có tiềm năng. Hình 3.14 cho thấy các cây chuyển gen dương tính với đoạn rd29A::ZmDREB2.7tv cũng dương tính với gen
Hình 3.14. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen HygR trong cây chuyển gen thế hệ T0
M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). +: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid pCAMBIA1300/rd29A::ZmDREB2.7::polyA; - : Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của cây không chuyển gen;1-11: Sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các
cây chuyển gen tương ứng.
Từ kết quả sàng lọc bằng thí nghiệm PCR trên tổng số 76 cây T0 tái sinh, 30 cây chuyển gen thế hệ T0 dương tính đồng thời với sự có mặt của đoạn
rd29A::ZmDREB2.7tv và gen HygR. Có thể thấy, tỷ lệ cây tái sinh mang gen
ZmDREB2.7tv không cao (30/91 = 32,97%). Điều này là kết quả của nhiều mô sẹo không nhận gen chuyển nhưng vẫn có khả năng thoát khỏi áp lực chọn lọc bằng hygromycin và sau đó, có cơ hội tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Khi ở môi trường chọn lọc, các mô sẹo thực chất là thể khảm bao gồm các tế bào có sự chèn của T- DNA và tế bào bình thường ban đầu. Mặc dù đặt dưới áp lực chọn lọc, các tế bào không chứa T-DNA vẫn được bảo vệ do kích thước của mô sẹo lớn [15]. Điều này giúp các tế bào không được chuyển gen vẫn có khả năng sống sót và phát triển. Hơn nữa, khi phân tách mô sẹo và chuyển sang môi trường tái sinh 2, các tế bào bình thường này phát triển thành cây bình thường do không còn kháng sinh hygromycin trong môi trường nữa. Đồng thời, mật độ cao của mô sẹo trên một đĩa petri cũng có thể là nguyên nhân giúp các tế bào không chứa cấu trúc mang gen ZmDREB2.7tv
sống sót.
Hiệu suất chuyển gen được tính bằng tổng số cây tái sinh mang gen chuyển trên tổng số phôi được lây nhiễm với giá trị trung bình của ba lần chuyển gen là 0,99%. Con số này tương đối thấp so với các công bố trên thế giới, tuy nhiên cao hơn so với một vài công bố ở nước ta. Nguyên nhân có thể là do các nghiên cứu
trước đây tiến hành chuyển gen ngô trên các nguyên liệu khác nhau. Năm 2014, Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự thực hiện chuyển gen vào nguyên liệu là mô sẹo trên ba dòng nền là V152N, C436 và C7N với hiệu suất chuyển gen lần lượt là 0,9%, 0,28% và 0,5% [5]. Như vậy, đặc điểm dòng nền và nguyên liệu chuyển gen có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chuyển gen.