- Cây ngô chuyển gen thế hệ T0 được tạo ra theo phương pháp chuyển gen như mô tả ở mục 2.2.9. Các cây ngô chuyển gen thế hệ T1, T2 được thu bằng cách tự thụ phấn cây T0, T1 tương ứng.
- Các cây chuyển gen ở các thế hệ được thu lá để tách DNA tổng số theo quy trình ở mục 2.2.1. Sau đó, sự có mặt của các đoạn gen quan tâm: gen ZmDREB2.7tv
và HygR được kiểm tra bằng phản ứng PCR như mô tả ở mục 2.2.3.
- Sự phân ly của gen ZmDREB2.7tv được đánh giá bằng phương pháp chi bình phương (χ2) để tìm ra tỷ lệ phù hợp nhất. Nếu giá trị χ2 < 3,841 thì tỷ lệ phân ly được cho là đúng với mức ý nghĩa α=0,05, ngược lại là giả thuyết sai.
- Số lượng bản sao của gen chuyển trong cây chuyển gen thế hệ T1 được ước lượng bằng phương pháp real-time PCR định lượng tuyệt đối như mô tả ở mục 2.2.10.
- Để đánh giá sự biểu hiện của gen quan tâm trong cây ngô biến đổi gen thế hệ T2 và cây không chuyển gen, các cây ở giai đoạn 3 lá được gây hạn nhân tạo bằng dung dịch PEG 6000 (polyethylene glycol) 20% trong 6 giờ. Lá của các cây được thu trước và sau khi xử lý hạn để tách RNA và tiến hành phản ứng real-time PCR định lượng tương đối như mô tả ở mục 2.2.11.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập gen ZmDREB2.7tv từ cây ngô Tẻ vàng 1
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá cây ngô Tẻ vàng 1
Giống ngô Tẻ vàng 1 là giống ngô địa phương thuộc tỉnh Điện Biên do Viện Nghiên cứu ngô thu thập và đánh giá. Giống ngô này có thời gian sinh trưởng ngắn (98 ngày), thuộc nhóm chín sớm, có chiều cao cây cao và chiều cao đóng bắp trung bình (196,3 và 90,1 cm); khả năng bị sâu đục thân và rệp thấp, không bị nhiễm khô vằn. Giống ngô có thân cứng cáp, không bị đổ, có khả năng chịu hạn tốt. Theo thang đo khả năng chịu hạn dựa trên mức độ xoăn của lá khi cây gặp hạn, trong đó 1 là chịu hạn tốt nhất và 5 là nhạy cảm với hạn, giống ngô địa phương này được cho điểm 1. Do đó, Tẻ vàng 1 là nguồn vật liệu tốt để phân lập các gen liên quan đến tính trạng chịu hạn ở ngô, phục vụ công tác tạo cây ngô biến đổi gen.
Qua tham khảo nghiên cứu về họ gen DREB ở cây ngô của Liu và cộng sự [22], đoạn gen ZmDREB2.7 của ngô tham chiếu B73 không chứa intron. Do đó, gen quan tâm được phân lập gen trực tiếp từ DNA tổng số cây ngô Tẻ vàng 1. DNA được tách từ các mẫu lá ở giai đoạn cây ngô ba lá theo quy trình đã trình bày ở phần phương pháp (Mục 2.2.1). Kết quả cho thấy DNA được tách chiết từ các mẫu lá khác nhau đều có chất lượng tốt, ít bị đứt gãy, đồng thời đã loại bỏ được hầu hết RNA (Hình 3.1). Như vậy DNA đạt chất lượng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Phân lập và tạo dòng gen ZmDREB2.7tv
Thí nghiệm phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực hiện thông qua phản ứng PCR với khuôn là DNA tổng số của cây ngô Tẻ vàng 1. Dựa vào nghiên cứu của Liu và cộng sự [22] và tham khảo thêm trên trang maizegdb.org, vị trí của vùng gen
ZmDREB2.7tv được xác định. Từ đó, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế nằm ngoài vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7 nhằm khuếch đại trình tự có độ dài theo tính toán là 1338 bp chứa trình tự mã hóa gen ZmDREB2.7tv, vùng 5’UTR và 3’ UTR của gen này trên cây ngô Tẻ vàng 1.
Phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7tv được thực hiện như đã mô tả ở phần phương pháp (Mục 2.2.7). Sản phầm PCR có kích thước gần 1,5 kb được tinh sạch bằng kit PCR GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng sau đó. Đoạn gen ZmDREB2.7tv đã phân lập được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 theo hướng dẫn của CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Vector pJET1.2 có nhiều đặc điểm phù hợp của một vector nhân dòng như: số lượng bản sao trong tế bào lớn, có khả năng sao chép độc lập với tế bào E. coli chủ nhờ trình tự ori, có gen kháng kháng sinh ampicillin (AmpR) hỗ trợ cho thí nghiệm chọn lọc, chứa vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site - MCS) giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA chèn. Vector pJET1.2 cung cấp trong bộ kit ở dạng mở vòng và đầu bằng. Trong khi đó, sản phẩm PCR với enzyme DreamTaq DNA polymerase có đoạn dA ở đầu 3’. Do đó, sản phẩm PCR được xử lý với enzyme DNA Blunting trước khi tiến hành ghép nối với vector. Enzyme DNA Blunting là một DNA polymerase bền nhiệt với hoạt tính đọc sửa, nó sẽ loại bỏ đầu dư thừa 3’ và lấp đầy đầu dính 5’ để tạo đầu bằng.
Sản phẩm ghép nối giữa đoạn trình tự ZmDREB2.7tv và vector pJET1.2 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Các tế bào sau đó được nuôi cấy trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 50 mg/mL ở 37°C qua đêm. Nhiều khuẩn lạc đơn mọc trên đĩa biết nạp là các dòng vi khuẩn có
mang plasmid pJET1.2. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn trình tự đã phân lập hay không, plasmid từ một vài khuẩn lạc được tách chiết để kiểm tra.
Kết quả plasmid tách từ 6 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp được thể hiện trên hình 3.2. Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai có kích thước lớn hơn, do đó phân ly chậm hơn trong quá trình điện di. Vì vậy, khi so sánh độ cao của các băng DNA trên gel agarose, có thể nhận thấy plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc (KL1, KL4-6) cao hơn plasmid đối chứng (pJET1.2 trống) và plasmid từ hai dòng khuẩn lạc khác (KL2, KL3). Vì vậy, sự có mặt của trình tự chèn trong các plasmid tái tổ hợp tiếp tục được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn.
Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv 1 - 6 : Plasmid tách từ sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pJET1.2/ZmDREB2tv
lần lượt là KL1 - KL6; 7: Plasmid pJET1.2 trống (đối chứng).
Khi phân tích vùng nhân dòng đa điểm của vector pJET1.2, nhận thấy hai phía của vị trí ghép nối đều có trình tự nhận biết của enzyme BglII. Do đó, enzyme
BglII được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự ZmDREB2.7tv trong vector nhân dòng từ các KL1, KL4-6. Sau khi xử lý với enzyme giới hạn trong 3 giờ, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.3).
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng enzyme giới hạn BglII.
M: GeneRulerTM 1kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm xử lý plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL1, KL4 - 6 với enzyme giới hạn. 5: Đoạn gen
ZmDREB2tv được phân lập.
Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme BglII cho thấy, ở cả 4 dòng khuẩn lạc đều cho 2 băng DNA rõ rệt. Một băng có kích thước tương đương với sản phẩm PCR nhân trình tự ZmDREB2.7tv (đường chạy 5, Hình 3.4). Một băng có kích thước lớn hơn (khoảng 3,0 kb) là kích thước của vector pJET1.2 khi xử lý với BglII. Như vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn, có thể dự đoán rằng, plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc KL1, KL4-6 chứa đoạn chèn là trình tự ZmDREB2.7tv được phân lập từ cây ngô Tẻ vàng 1. Để kiểm chứng giả thuyết, các plasmid được tinh sạch và đọc trình tự.
3.1.3. Phân tích trình tự gen ZmDREB2.7tv
Các plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc được dự đoán mang trình tự ZmDREB2.7tv
được đọc trình tự hai chiều với mồi của vector là pJET1.2 forward sequencing primer và pJET1.2 reverse sequencing primer theo phương pháp Sanger. Kết quả đọc trình tự được xử lý trên phần mềm BioEdit và thu được trình tự consensus của cả 4 plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc. Các trình tự đều giống nhau gồm 1,327 nucleotides, trong đó vùng khung đọc mở có kích thước 1,077 bp.
Trình tự ZmDREB2.7tv được BLAST trên NCBI thu được kết quả có độ tương đồng cao nhất với kết quả PREDICTED: Zea mays dehydration-responsive element-binding protein 2C (LOC103643169), mRNA (độ tương đồng 98%, độ bao phủ 97%). Tuy nhiên, đến ngày 18/12/2017, trình tự này được chú thích lại thành PREDICTED: Zea mays ethylene-responsive transcription factor ABI4 (LOC103643169), mRNA. Việc đặt tên cho locus dựa theo các phân tích tính toán tự động bằng phương pháp dự đoán gen: Gnomon., được bổ sung dữ liệu bởi sự tương đồng với 2 mRNA, 6 EST và 100% bao phủ với annotated genomic feature by RNAseq alignments. Ngoài ra, các kết quả khác có độ dài thấp hơn, tập trung vào vùng từ nucleotide 300-600, với độ tương đồng đều lớn hơn 80%. Trong đó các trình tự chủ yếu mã hóa cho dehydration-responsive element-binding protein 2C- like hoặc ethylene-responsive transcription factor thuộc các loài như Triticum aestivum, Oryza sativa, Eucalyptus qunnii, Sorghum bicolor. Các protein này đều có vùng bám DNA đặc trưng cho họ AP2/ERF2.
Trình tự ZmDREB2.7tv phân lập từ cây Tẻ vàng 1 được so sánh với trình tự tham chiếu cây ngô B73 trên cơ sở dữ liệu maizegdb.org. Kết quả cho thấy trình tự
ZmDREB2.7tv tương đồng 1310/1334 bp (98,02%), gap = 13 (0,97%) với trình tự từ 204458353 đến 204459686 trên NST số 1 của hệ gen tham chiếu (Hình 3.4).
Từ kết quả xác định trình tự, đoạn trình tự bp phân lập được có chứa vùng 5’UTR và 3’UTR của gen với kích thước lần lượt là 207 bp và 53 bp (Hình 3.4). Ở vùng phía trước của gen, nhiều yếu tố hoạt động cis đặc trưng của vùng promoter được xác định như TATA box, E-box, hay LTRE 1 (low-temperature responsive- element 1). Vị trí khởi đầu tái bản được dự đoán cách codon mở đầu khoảng 100 nucleotide (vị trí có mũi tên trỏ xuống). Đồng thời, nhiều điểm khác nhau giữa trình tự gen của giống địa phương Tẻ vàng 1 và cây ngô tham chiếu B73 được phát hiện gồm: 11 vị trí thay thế nucleotide và 4 vị trí thêm/mất nucleotide. Các biến đổi này xảy ra ở vùng promoter của gen và nằm rải rác trong vùng mã hóa.
Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự ZmDREB2tv phân lập từ giống ngô Tẻ vàng 1 và trình tự tham chiếu ngô B73 bằng công cụ BioEdit.
Vùng khung đọc mở được thể hiện bằng chữ in hoa, vùng 5’ và 3’UTR được thể hiện bằng chữ in thường. Vùng trình tự mã hóa domain bám DNA được thể hiện bằng chữ có gạch
chân. Mũi tên chỉ vào vị trí khởi đầu tái bản dự đoán. Các trình tự cis-element trên promoter được đóng khung trong hình chữ nhật với tên ở dưới. Các biến đổi dạng thay thế
nucleotide được thể hiện bằng hình tròn (●), các biến đổi dạng mất hoặc thêm nucleotide được thể hiện bằng hình tam giác (▲). Các biến đổi trên nucleotide không thay đổi amino
Sử dụng công cụ online (https://web.expasy.org/translate) để dịch mã đoạn gen ZmDREB2.7tv thu được trình tự protein với 358 amino acid và có khối lượng phân tử là 38,1 kDa với điểm đẳng điện lý thuyết là 6,42. Khi so sánh trình tự protein suy diễn của cây ngô địa phương Tẻ vàng 1 và cây ngô tham chiếu B53, có thể nhận thấy một vài điểm khác biệt xảy ra ở vùng nucleotide mã hóa cho domain bám DNA của protein ZmDREB2.7 không làm thay đổi trình tự chuỗi polypeptide. Trong khi đó, 5 vị trí thay thế nucletotide làm thay đổi thành phần amino acid ở đầu C của protein (chấm tròn màu đỏ). Cụ thể, trên hình 3.4, vị trí 806: A G dẫn đến Met > Val, vị trí 872: T A dẫn đến Cys > Ser, vị trí 927: T C dẫn đến Met > Thr, vị trí 945: T dẫn đến Leu > Pro, vị trí 948: A C dẫn đến Gln > Pro. Các thay đổi này có thể ảnh hưởng đến sự tương tác và cuộn gấp của protein. Tuy nhiên, vùng domain bám DNA của protein (vùng gạch chân trên hình 3.4) không thay đổi so với cây ngô B73. Như vậy, protein ZmDREB2.7tv có khả năng bám vào các trình tự đặc trưng như các protein khác trong họ DREB.
3.2. Kết quả thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmDREB2.7tv
3.2.1. Thiết kế vector trung gian pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv
Trong nghiên cứu này, phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn A. tumefaciens
và vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300 được sử dụng để đưa gen
ZmDREB2.7tv vào cây ngô. Việc lựa chọn promoter để điều hòa gen chuyển đóng vai trò quan trọng trong việc thành công của cây chuyển gen. Tùy vào mục đích chuyển gen và vai trò của gen trong cây mà có thể lựa chọn một trong ba loại promoter: promoter cơ định, promoter đặc hiệu mô và promoter cảm ứng. Như đã đề cập ở trên, gen ZmDREB2.7tv mã hóa cho protein là một nhân tố phiên mã, có khả năng đóng và mở các gen trong con đường chống chịu với hạn. Do đó, việc biểu hiện protein này khi cần thiết và không biểu hiện trong điều kiện bình thường sẽ mang lại nhiều lợi thế cho cây. Thứ nhất, cây không lãng phí dinh dưỡng và năng lượng để tổng hợp protein ZmDREB2.7 trong điều kiện bình thường. Thứ hai, việc biểu hiện các protein này có thể sẽ gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường
của cây. Do đó, trong nghiên cứu này, promoter của gen cảm ứng mạnh với hạn
rd29A, phân lập từ cây A. thaliana được lựa chọn để điều hòa gen ZmDREB2.7tv. Promoter rd29A đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu biểu hiện gen thực vật khác nhau [20].
Cấu trúc biểu hiện của gen chuyển bao gồm promoter rd29A, gen
ZmDREB2.7tv và trình tự tín hiệu polyA được xây dựng qua trung gian vector pRTL2. Vector pRTL2 đã có sẵn promoter rd29A và tín hiệu polyA trong bộ khung vector. Do đó, bằng việc sử dụng phương pháp cắt và nối với enzyme, đoạn gen
ZmDREB2.7tv được chèn vào vị trí SacI của vector như mô tả trong hình 2.1.
Để chèn gen ZmDREB2.7tv vào vị trí SacI trên vector pRTL2, phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F/R được sử dụng để bổ sung vị trí nhận biết của enzyme này ở hai đầu của gen. Với khuôn là vector nhân dòng pJET1.2/ZmDREB2.7tv, phản ứng khuếch đại toàn bộ vùng mã hóa của gen
ZmDREB2.7tv (1077 bp) với kích thước lý thuyết của sản phẩm PCR là 1089 bp.
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv. M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). 1: Sản phẩm PCR với khuôn là
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, đoạn mã hóa của gen ZmDREB2.7tv đã được khuếch đại thành công với kích thước xấp xỉ 1,1 kb như tính toán. Đồng thời, hai đầu của đoạn mã hóa được gắn thêm vị trí nhân biết của enzyme SacI, phục vụ cho thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen.
Đoạn mã hóa gen ZmDREB2.7tv được tạo đầu dính bằng enzyme giới hạn
SacI. Đồng thời, vector pRTL2 cũng được mở vòng bằng enzyme tương ứng. Hai sản phẩm cắt được ghép nối nhờ enzyme T4 ligase và sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Đĩa biến nạp sau khi nuôi qua đêm ở 37°C xuất hiện nhiều khuẩn lạc đơn. Do đó, các khuẩn lạc được sàng lọc để chọn ra các dòng có mang đoạn chèn như phương pháp đã thực hiện ở trên.
Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv
1 - 10 : Plasmid tách từ 10 khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv lần lượt là KL1 - KL10; 11: Plasmid pRTL2 trống (đối chứng).
Kết quả điện di các plasmid tách từ 10 khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên được thể hiện trên hình 3.6. Do 3 khuẩn lạc KL3, KL4 và KL6 cho băng plasmid cao hơn plasmid pRTL2 trống, plasmid từ 3 khuẩn lạc này được cho là có chứa đoạn gen
ZmDREB2.7tv. Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen quan tâm trong vector, các plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn SacI. Theo lý thuyết, khi có mặt của đoạn gen ZmDREB2.7tv, sản phẩm của phản ứng cắt gồm 2 băng DNA có kích thước lần lượt xấp xỉ 3,7 kb (khung vector pRTL2) và 1,1 kb (đoạn gen chèn). Kết quả kiểm tra với enzyme giới hạn trên hình 3.7A cho thấy, cả ba plasmid từ ba