Trong nghiên cứu này, phương pháp chuyển gen qua vi khuẩn A. tumefaciens
và vector biểu hiện thực vật pCAMBIA1300 được sử dụng để đưa gen
ZmDREB2.7tv vào cây ngô. Việc lựa chọn promoter để điều hòa gen chuyển đóng vai trò quan trọng trong việc thành công của cây chuyển gen. Tùy vào mục đích chuyển gen và vai trò của gen trong cây mà có thể lựa chọn một trong ba loại promoter: promoter cơ định, promoter đặc hiệu mô và promoter cảm ứng. Như đã đề cập ở trên, gen ZmDREB2.7tv mã hóa cho protein là một nhân tố phiên mã, có khả năng đóng và mở các gen trong con đường chống chịu với hạn. Do đó, việc biểu hiện protein này khi cần thiết và không biểu hiện trong điều kiện bình thường sẽ mang lại nhiều lợi thế cho cây. Thứ nhất, cây không lãng phí dinh dưỡng và năng lượng để tổng hợp protein ZmDREB2.7 trong điều kiện bình thường. Thứ hai, việc biểu hiện các protein này có thể sẽ gây ảnh hưởng đến sự sinh trưởng bình thường
của cây. Do đó, trong nghiên cứu này, promoter của gen cảm ứng mạnh với hạn
rd29A, phân lập từ cây A. thaliana được lựa chọn để điều hòa gen ZmDREB2.7tv. Promoter rd29A đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu biểu hiện gen thực vật khác nhau [20].
Cấu trúc biểu hiện của gen chuyển bao gồm promoter rd29A, gen
ZmDREB2.7tv và trình tự tín hiệu polyA được xây dựng qua trung gian vector pRTL2. Vector pRTL2 đã có sẵn promoter rd29A và tín hiệu polyA trong bộ khung vector. Do đó, bằng việc sử dụng phương pháp cắt và nối với enzyme, đoạn gen
ZmDREB2.7tv được chèn vào vị trí SacI của vector như mô tả trong hình 2.1.
Để chèn gen ZmDREB2.7tv vào vị trí SacI trên vector pRTL2, phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F/R được sử dụng để bổ sung vị trí nhận biết của enzyme này ở hai đầu của gen. Với khuôn là vector nhân dòng pJET1.2/ZmDREB2.7tv, phản ứng khuếch đại toàn bộ vùng mã hóa của gen
ZmDREB2.7tv (1077 bp) với kích thước lý thuyết của sản phẩm PCR là 1089 bp.
Hình 3.5. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại vùng mã hóa gen ZmDREB2.7tv. M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific). 1: Sản phẩm PCR với khuôn là
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, đoạn mã hóa của gen ZmDREB2.7tv đã được khuếch đại thành công với kích thước xấp xỉ 1,1 kb như tính toán. Đồng thời, hai đầu của đoạn mã hóa được gắn thêm vị trí nhân biết của enzyme SacI, phục vụ cho thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen.
Đoạn mã hóa gen ZmDREB2.7tv được tạo đầu dính bằng enzyme giới hạn
SacI. Đồng thời, vector pRTL2 cũng được mở vòng bằng enzyme tương ứng. Hai sản phẩm cắt được ghép nối nhờ enzyme T4 ligase và sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Đĩa biến nạp sau khi nuôi qua đêm ở 37°C xuất hiện nhiều khuẩn lạc đơn. Do đó, các khuẩn lạc được sàng lọc để chọn ra các dòng có mang đoạn chèn như phương pháp đã thực hiện ở trên.
Hình 3.6. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv
1 - 10 : Plasmid tách từ 10 khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pRTL2/rd29A: :ZmDREB2.7tv lần lượt là KL1 - KL10; 11: Plasmid pRTL2 trống (đối chứng).
Kết quả điện di các plasmid tách từ 10 khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên được thể hiện trên hình 3.6. Do 3 khuẩn lạc KL3, KL4 và KL6 cho băng plasmid cao hơn plasmid pRTL2 trống, plasmid từ 3 khuẩn lạc này được cho là có chứa đoạn gen
ZmDREB2.7tv. Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen quan tâm trong vector, các plasmid này được xử lý với enzyme giới hạn SacI. Theo lý thuyết, khi có mặt của đoạn gen ZmDREB2.7tv, sản phẩm của phản ứng cắt gồm 2 băng DNA có kích thước lần lượt xấp xỉ 3,7 kb (khung vector pRTL2) và 1,1 kb (đoạn gen chèn). Kết quả kiểm tra với enzyme giới hạn trên hình 3.7A cho thấy, cả ba plasmid từ ba khuẩn lạc trên đều mang gen ZmDREB2.7tv.
A B
Hình 3.7. Kết quả kiểm tra plasmid pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv
A. Điện di đồ sản phẩm xử lý các plasmid bằng enzyme giới hạn SacI. M: HyperLadderTM
1kb (Bioline); 1 - 3: Sản phẩm xử lý plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL3, KL4 và KL 6 với enzyme SacI.
B. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra plasmid. M: GeneRulerTM
1kb DNA Ladder (Thermo Scientific); 1- 3: Sản phẩm PCR với khuôn là plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL3,
KL4 và KL 6; 4: Sản phẩm PCR với khuôn là nước.
Tuy nhiên, khi đoạn gen được chèn vào vector bằng một enzyme giới hạn, gen có thể được chèn vào giữa vùng promoter và terminator theo hai chiều. Do đó, trong nghiên cứu này, phản ứng PCR với cặp mồi ZmDREB2.7_SacI_F - polyA_R được sử dụng để kiểm tra chiều của gen. Nếu gen chèn đúng chiều, sản phẩm PCR thu được có kích thước xấp xỉ 1,3 kb còn nếu gen chèn ngược chiều sẽ không thu được sản phẩm PCR nào. Kết quả trên hình 3.7B cho thấy, trong 3 khuẩn lạc, khuẩn lạc KL4 (đường chạy số 2) không cho sản phẩm PCR, điều này chứng tỏ KL4 chứa đoạn gen chèn nằm ngược chiều so với cấu trúc biểu hiện. Trong khi đó, hai khuẩn lạc còn lại KL3 và KL6 cho sản phẩm PCR là một băng kích thước xấp xỉ 1,3 kb đậm và sáng (đường chạy số 1 và 3). Vector pRTL2/rd29A::ZmDREB2.7tv tách từ KL3 được đọc trình tự và xác nhận tính đúng đắn và sự toàn vẹn của cấu trúc biểu hiện gen. Như vậy, đã tạo được vector pRTL2 mang cấu trúc biểu hiện