Thí nghiệm phân lập gen ZmDREB2.7tv được thực hiện thông qua phản ứng PCR với khuôn là DNA tổng số của cây ngô Tẻ vàng 1. Dựa vào nghiên cứu của Liu và cộng sự [22] và tham khảo thêm trên trang maizegdb.org, vị trí của vùng gen
ZmDREB2.7tv được xác định. Từ đó, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế nằm ngoài vùng mã hóa của gen ZmDREB2.7 nhằm khuếch đại trình tự có độ dài theo tính toán là 1338 bp chứa trình tự mã hóa gen ZmDREB2.7tv, vùng 5’UTR và 3’ UTR của gen này trên cây ngô Tẻ vàng 1.
Phản ứng PCR phân lập trình tự ZmDREB2.7tv được thực hiện như đã mô tả ở phần phương pháp (Mục 2.2.7). Sản phầm PCR có kích thước gần 1,5 kb được tinh sạch bằng kit PCR GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) để làm nguyên liệu cho thí nghiệm nhân dòng sau đó. Đoạn gen ZmDREB2.7tv đã phân lập được gắn vào vector nhân dòng pJET1.2 theo hướng dẫn của CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, Mỹ). Vector pJET1.2 có nhiều đặc điểm phù hợp của một vector nhân dòng như: số lượng bản sao trong tế bào lớn, có khả năng sao chép độc lập với tế bào E. coli chủ nhờ trình tự ori, có gen kháng kháng sinh ampicillin (AmpR) hỗ trợ cho thí nghiệm chọn lọc, chứa vùng nhân dòng đa điểm (multiple cloning site - MCS) giúp dễ dàng kiểm tra đoạn DNA chèn. Vector pJET1.2 cung cấp trong bộ kit ở dạng mở vòng và đầu bằng. Trong khi đó, sản phẩm PCR với enzyme DreamTaq DNA polymerase có đoạn dA ở đầu 3’. Do đó, sản phẩm PCR được xử lý với enzyme DNA Blunting trước khi tiến hành ghép nối với vector. Enzyme DNA Blunting là một DNA polymerase bền nhiệt với hoạt tính đọc sửa, nó sẽ loại bỏ đầu dư thừa 3’ và lấp đầy đầu dính 5’ để tạo đầu bằng.
Sản phẩm ghép nối giữa đoạn trình tự ZmDREB2.7tv và vector pJET1.2 được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH10β. Các tế bào sau đó được nuôi cấy trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicillin ở nồng độ 50 mg/mL ở 37°C qua đêm. Nhiều khuẩn lạc đơn mọc trên đĩa biết nạp là các dòng vi khuẩn có
mang plasmid pJET1.2. Để xác định xem các plasmid này có mang đoạn trình tự đã phân lập hay không, plasmid từ một vài khuẩn lạc được tách chiết để kiểm tra.
Kết quả plasmid tách từ 6 khuẩn lạc chọn ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp được thể hiện trên hình 3.2. Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai có kích thước lớn hơn, do đó phân ly chậm hơn trong quá trình điện di. Vì vậy, khi so sánh độ cao của các băng DNA trên gel agarose, có thể nhận thấy plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc (KL1, KL4-6) cao hơn plasmid đối chứng (pJET1.2 trống) và plasmid từ hai dòng khuẩn lạc khác (KL2, KL3). Vì vậy, sự có mặt của trình tự chèn trong các plasmid tái tổ hợp tiếp tục được kiểm tra bằng cách xử lý với enzyme giới hạn.
Hình 3.2. Điện di đồ plasmid tách từ các khuẩn lạc tái tổ hợp pJET1.2/ZmDREB2.7tv 1 - 6 : Plasmid tách từ sáu khuẩn lạc ngẫu nhiên trên đĩa biến nạp pJET1.2/ZmDREB2tv
lần lượt là KL1 - KL6; 7: Plasmid pJET1.2 trống (đối chứng).
Khi phân tích vùng nhân dòng đa điểm của vector pJET1.2, nhận thấy hai phía của vị trí ghép nối đều có trình tự nhận biết của enzyme BglII. Do đó, enzyme
BglII được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự ZmDREB2.7tv trong vector nhân dòng từ các KL1, KL4-6. Sau khi xử lý với enzyme giới hạn trong 3 giờ, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% (Hình 3.3).
Hình 3.3. Điện di đồ sản phẩm xử lý plasmid pJET1.2/ZmDREB2.7tv bằng enzyme giới hạn BglII.
M: GeneRulerTM 1kb Plus DNA Ladder (Thermo Scientific); 1 - 4: Sản phẩm xử lý plasmid từ các khuẩn lạc lần lượt gồm KL1, KL4 - 6 với enzyme giới hạn. 5: Đoạn gen
ZmDREB2tv được phân lập.
Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme BglII cho thấy, ở cả 4 dòng khuẩn lạc đều cho 2 băng DNA rõ rệt. Một băng có kích thước tương đương với sản phẩm PCR nhân trình tự ZmDREB2.7tv (đường chạy 5, Hình 3.4). Một băng có kích thước lớn hơn (khoảng 3,0 kb) là kích thước của vector pJET1.2 khi xử lý với BglII. Như vậy, qua kết quả kiểm tra bằng enzyme giới hạn, có thể dự đoán rằng, plasmid từ 4 dòng khuẩn lạc KL1, KL4-6 chứa đoạn chèn là trình tự ZmDREB2.7tv được phân lập từ cây ngô Tẻ vàng 1. Để kiểm chứng giả thuyết, các plasmid được tinh sạch và đọc trình tự.