Phƣơng pháp nghiên cứu

Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu

2.4.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu tế bào

2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào

Dung dịch tế bào được chuẩn bị trong dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM pH 7,0 với mật độ khoảng 109 tế bào/ml. Dịch tế bào được pha loãng trong dung dịch peptone 1% ở các mật độ nhỏ dần 10 lần và được cấy trải trên đĩa thạch TSA, nuôi ở 37C cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt và có thể đếm bằng mắt thường [10].

2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop)

Khả năng sinh acid của tế bào được đánh giá thông qua việc làm giảm pH của môi trường bên ngoài dẫn đến sự tụt pH (pH drop). Các giá trị pH tại mỗi thời điểm nghiên cứu nhất định được đo bằng máy đo pH.

Sau khi thu tế bào từ biofilm bằng cách ly tâm 6000 gở 40C trong 15 phút, tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM.Sau đó, tế bào được hòa trở lại trong dung dịch muối này ở mật độ khoảng 5 x 109 CFU/ml, tương đương 2 mg trọng lượng khô tế bào/ml. pH của dịch tế bào được chỉnh đến 7,2 bằng KOH 1M. Glucose được bổ sung vào để đạt nồng

độ cuối cùng là 0,04%, đảm bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân. Sự giảm pH môi trường do sự sinh acid trong quá trình đường phân được theo dõi sử dụng máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức [10].

2.4.2. Các phƣơng pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme

2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm

Tế bào S.mutans được thu hoạch từ biofilm sau 68 giờ nuôi cấy . Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Cặn tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM, sau đó tế bào được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM. Sau khi thêm toluene (tỉ lệ 1 : 10 thể tích), dịch tế bào được trộn đều và ủ ở 370

C trong 5 phút. Tế bào nhanh chóng đươ ̣c làm đông lạnh trong hỗn hợp đá khô với ethanol trong 1 phút. Ngay sau đó, dịch tế bào được làm tan ở 370C trong 5 phút. Chu kỳ này được lặp lại 2 lần. Toluene được loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Tế bào thấm được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM và được cất giữ ở -700C đến khi dùng [10].

2.4.2.2. Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS)

Hoạt động của hệ thống ezyme chuyển hóa đường (PTS) được xác định theo phương pháp của Belli và Marquirs [16]. Phản ứng được thực hiện với tế bào thấm. Hoạt độ của enzyme được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành là pyruvate từ phosphoenolpyruvate, là sản phẩm trung gian khi tế bào tiêu thụ glucose. Pyruvate tạo thành được xác định bằng enzyme lactate dehydrogenase trong sự có mặt của NADH. Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm Tris – malate 50 mM (có chứa MgCl2 20 mM, NAF 1 mM và glucose 40 mM, pH 7,0), MgCl2 10 mM, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, ADP và tế bào thấm. Phản ứng được bắt đầu bằng việc thêm vào hỗn hợp phản ứng phosphoenolpyruvate (PEP) 10 mM. Đo độ hấp thụ tại A340.

Một đơn vị hoạt độ PTS là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 1µmole pyruvate thành lactate trong 1 phút, tương ứng với 1µmole glucose được phosphoryl hóa trong 1 phút ở điều kiện phân tích.

2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase

ATPase được xác định với tế bào thấm theo phương pháp của Sturr và Marquis [55]. Hoạt động của enzyme được xác định thông qua việc đo lượng phospho vô cơ được giải phóng ra sử dụng thuốc thử Beccini. Thuốc thử này có chứa ZnCl2 100mM và amonium molybdate 15mM. Hỗn hợp phản ứng enzym có chứa đệm Tris – malate 100 mM, pH 7,0, MgCl2 10 mM và tế bào thấm. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung ATP 5 mM. Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp này được ly tâm với tốc độ 6.000 g ở 40C trong 15 phút. Phần dịch trên kết tủa được trộn đều với thuốc thử Beccini và đo độ hấp thụ ở A350. Lượng phospho trong mẫu nghiên cứu được tính dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch phospho chuẩn (Sigma).

Một đơn vị hoạt độ ATPase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 µmole phospho vô cơ trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.

2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF)

Hoạt độ GTF được xác định theo phương pháp của Koo và cs [35]. GTFB và GTFC thu được từ những chủng tế bào tái tổ hợp mang gen sinh tổng hợp chỉ một loại enzyme này. Chủng S. milleri KSB8 mang gen gtfB lấy từ chủng S. mutans GS-5. Chủng S. mutans WHB 410 có các gen gtfB và gtfD đã bị cắt bỏ

chỉ còn gen gtfC. Các enzyme GTFB và GTFC là những chế phẩm enzyme tinh

sạch đến mức gần đồng nhất, sử dụng cột sắc ký hydroxyapatite theo phương pháp của Venkitaraman và cs [56]. Trong thí nghiệm ở đây, các enzyme GTFB và GTFC được Koo H. (Trung tâm Sinh học Xoang miệng, Đại học Rochester, Hoa Kỳ) cung cấp.

Một đơn vị hoạt độ enzyme GTF là lượng emzym cần thiết để kết hợp 1,0 mol glucose vào glucan trong 4 giờ phản ứng ở điều kiện thí nghiệm.

Hoạt độ enzyme được xác định đối với enzyme ở trạng thái enzyme hoà tan trong dung dịch. Các enzyme GTFC và GTFB được trộn đều với chất nghiên cứu và được ủ với cơ chất [14C-glucose]- sucrose. Hỗn hợp phản ứng bao gồm cơ chất 0,2 Ci/ml, sucrose 200 mM, dextran 9000 40 mM, Na3N 0,02% và đệm hấp phụ có chứa KCl 50 mM, KHPO4 1,0mM, CaCl2 1,0 mM và MgCl2 0,1mM, pH 6,5. Mẫu đối chứng có chứa các thành phần tương tự chỉ khác là chất nghiên cứu được thay thế bằng ethanol. Hỗn hợp phản ứng được lắc liên tục trong 4 giờ ở 37o

C sau đó 1 ml ethanol lạnh được thêm vào để dừng phản ứng. Quá trình kết tủa glucan được thực hiện trong vòng 18 giờ ở 4oC. Các glucan có mang glucose đánh dấu được xác định bằng máy đếm nhấp nháy lỏng (Hoa Kỳ).

2.4.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu về biofilm

2.4.3.1. Tạo biofilm

Biofilm (mô hình bắt chước mảng bám răng) được hình thành trên các lam kính và trên các đĩa hydroxyapatite có đường kính 0,5 cm (Clarkson Chromatography Products Inc . Hoa Kỳ ) (Hình 2.1). Môi trường cho nuôi cấy tế bào biofilm có chứa tryptone 3%, dịch chiết nấm men 0,5% và sucrose 1%. Biofilm được thu hoạch sau 68 giờ nuôi cấy . Để tách rời các tế bào khỏi màng biofilm, các màng này đư ợc tách khỏi giá thể vào trong dung dịch NaCl 0,89% và sau đó đư ợc làm đồng nhất bằng máy nghiền đồng thể và máy siêu âm (Branson sonifier 150, Hoa Kỳ ). Biofilm đươ ̣c xử lý với chất nghiên cứu 2 lần/ngày, cách nhau 8 tiếng trong thời gian 1 phút. Trong mô ̣t số thí nghiê ̣m , biofilm cũng được ta ̣o trên nền giá đỡ là lam kí nh thủy tinh có kích thước 3 x 12 cm vớ i một quy trình tương tự [10], [35],[37].

Đĩa hydroxyapatite Giá đỡ biofilm Đĩa nuôi cấy biofilm

Hình 2.1. Mô hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mặt đi ̃a hydroxyapatite

2.4.3.2. Xác định thành phần biofilm

Sau 5 ngày nuôi cấy, biofilm được thu hoạch, siêu âm và dùng để đánh giá: i) Sinh khối biofilm: được thu lại sau khi ly tâm 10.000 g trong 10 phút ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

4oC. Phần tủa được rửa 2 lần với nước cất loại ion và xác định trọng lượng khô;

ii) Độ sốngcủa tế bào trên biofilm: được xác đi ̣nh bằng cách cấy trải tế bào trên biofilm lên đĩa tha ̣ch TSA.

2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá sinh khối biofilm (biomass) và sự phân bố các thành phần EPS và vi khuẩn trong các biofilm sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang đánh dấu in situ đặc hiệu kết hợp với phân tích hình ảnh trên kình hiển vi huỳnh quang đồng tụ quét laser (LSCFM). Phương pháp này cho phép phân tích định tính và quan sát được các tế bào vi khuẩn và thành phần EPS, qua đó kiểm tra chính xác được cấu trúc biofilm. Đánh dấu in situ EPS được thực hiện như sau: phức hợp dextran đánh dấu Alexa Fluor® 647-(10,000 MW; Molecular Probes Inc., Eugene, OR) được thêm vào môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển của biofilm. Dextran đánh dấu huỳnh quang đóng vai trò như là 1 primer cho các enzyme GTF và được kết hợp một cách tự động vào khung EPS trong quá trình hình thành biofilm nhưng không nhuộm tế bào vi khuẩn ở nồng độ sử dụng này. Vi khuẩn trong biofilm được đánh dấu với chất nhuộm acid nucleic SYTO® 9 green (480/500 nm; Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Hình ảnh của biofilm được quan sát sử

dụng kính hiển vi LSCFM. Mỗi biofilm được quét 5 lần tại một vị trí lựa chọn. Cấu trúc 3 chiều của biofilm được phân tích dùng phần mềm Amira™ 4.1.1 (Chelmsford, MS, USA)[37].

2.5. Đánh giá sƣ̣ tích lũy của α-mangostin trên biofilm

Biofilm được thu hoa ̣ch sau 68 giờ nuôi cấy. Sinh khối biofilm đươ ̣c thu lại bằng cách siêu âm và ly tâm ở 9.500gtrong 10 phút ở 4oC. Tủa biofilm được rửa 2 lần với nước loa ̣i ion . -mangostin được phản hấp phụ bằng viê ̣c rửa với 100% ethanol (Sigma). Hàm lượng -mangostin trên mỗi biofilm đ ược đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Alliance series 2695, detector PDA 2996 Waters, US). -mangostin thương mại 96% (ChromaDex) đươ ̣c sử dụng như là chất chuẩn. Các thông số đ ược sử dụng trên c ột HPLC là: column: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm, phase di động: H2O thêm 0,1% formic acid (channel A) và Acetonitrile (channel B), flow rate: gradient 1ml/min, detector PDA: 315 nm.

2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt

2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn có độ dày 1mm (60 F254, Merck). Các hệ dung môi phân tích được sử dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2: 1; ii) Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ 3:1. Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng. Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi NH3.

Sắc ký cột silica gel

Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Đối với sắc ký cột:

- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột có kích thước được tính toán dựa trên lươ ̣ng mẫu sẽ na ̣p lên cô ̣t .

- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rử a cô ̣t .

Trong thí nghiê ̣m này , phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi h ạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hê ̣ dung môi đã lựa cho ̣n với các bư ớc gradient khác nhau. Các phân đoạn tinh sạch sau đó được kiểm tra đô ̣ sa ̣ch bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cô ̣ng hưởng từ hạt nhân 1

HNMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).

2.6.2. Phân tích cấu trúc hó a học bằng cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ). Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung carbon. Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu.

2.7. Xử lý số liệu

Các số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sử dụng tiêu chuẩn t- test hoặc ANOVA trong trường hợp so sánh nhiều mẫu với giá trị p < 0,05.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt 3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt 3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt

Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện thấy cây măng cụt, đặc biệt là vỏ quả và vỏ cây, chứa nhiều hợp chất phenol nhất là nhóm chất xanthone trong đó

có -mangostin [1],[7]. Đến nay, đã có hơn 60 dẫn xuất xanthone khác nhau

trong măng cụt được tinh sạch và xác định cấu trúc (Dictionary of Natural Products - DNPonCD-Rom). Mặc dù đã tr ở thành chế phẩm hóa chất thương mại trong thời gian gần đây , nhưng giá thành c ủa chất này còn rất cao (150 USD/ 10 mg–Sigma).Trong khi đó, viê ̣c nghiên cứu sâu cũng như ứng dụng đòi hỏi cần một lượng chất lớn . Vì thế, việc tách và tinh sạch chúng từ nguồn nguyên liệu tự nhiên là cần thiết .

Để tinh sạch các xanthone, phần lớn các phòng thí nghiệm đều bắt đầu bằng việc sử dụng dịch chiết với ethanol hay methanol. Các xanthone sẽ được tinh sạch từ các dịch chiết này bằng phương pháp sắc ký trên các cột silica gel sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có tỉ lệ phân cực khác nhau để đẩy dần các chất này ra khỏi cột. Nhìn chung, để tinh sạch được một chất xanthone phải sử dụng thêm nhiều phương pháp sắc ký khác như sắc ký ngược pha, sắc ký trên cột sephadex LH-20, nên rất phức tạp và tốn kém. Nguyễn Thị Mai Phương và cscũng đã tách được α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:1:1 [10]. Tuy vậy, qui trình tách chiết chất này tỏ ra không hiệu quả mặc dù khá đơn gi ản vì hiệu suất thu hồi sản phẩm rất thấp. Các tác giả này cũng phát hiện thấy rằng các chất phenol có hoạt tính sinh học quan tâm là những chất có hệ số Rf lớn, nằm trong khoảng từ 8,0 đến 9,0 đồng nghĩa với việc chúng có tính phân cực thấp. Nhóm nghiên cứu này

sau đó đã đơn gi ản hóa quá trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt bằng cách sử dụng những phân đoạn chiết trong dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như toluene, chloroform hay n-hexane nhằm loại bỏ phần lớn các chất không mong muốn khác có trong nguyên liệu ban đầu. Dung môi n -hexane đã được lựa chọn vì nó có điểm sôi thấp hơn (61o

C) so với chloroform hay toluene (>100 oC) và cũng có hằng số lưỡng điện (dielectric constant) rất thấp (1,89 so với 4,81 của chloroform và 2,38 của toluene). Nhờ vậy, qui trình tinh sạch này đã có hiệu suất caohơn . Nhóm tác giả đã tinh sạch -mangostin sử dụng quy trình gồm các bước : i) tách chiết phân đoạn trong n-hexane; ii) sắc ký phân đoa ̣n cao chiết n-hexane trên 2 cô ̣t silica gel liên tiếp sử dụng h ệ dung môi rửa chiết n- hexane : ethyl acetate : methanol vớ i gradient dung môi có tính phân c ực giảm dần. Bằng quy trình này , -mangostin đã được tinh sạch hoàn toàn với hiệu suất thu hồi đạt 0,013% và đ ộ sạch đạt >98% [11]. Hiệu suất này cao hơn nhiều so với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng đã thực hiê ̣n trước đây [10]. Tuy nhiên, có thể thấy quy trình đ ược đưa ra vẫn chưa đa ̣ t hiê ̣u quả cao so với các quy trình đã được các tác giả khác công bố [10].

Với mục đích tìm ra đ ược quy trình tinh sa ̣ch -mangostin tối ưu hơn , trong nghiên cứu này , chúng tôi đã tiến hành tinh sa ̣ch -mangostin từ phân đoạn chiết n-hexane sử dụng cô ̣t sắc ký sil icagel với hê ̣ dụng môi rửa c hiết được thay đổi. Cụ thể như sau:

Bột nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô (2,0 kg) đã tiến hành chi ết rút với ethanol bằng phương pháp ngâm chiết theo tỉ lê ̣ 1 nguyên liê ̣u : 3 thể tích ethanol trong 3 ngày để thu cao ethanol tổng số . Ethanol đã được kh ẳng đi ̣nh là dung môi phù (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});