-mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S.mutans trên

3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trường

Vi khuẩn S. mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu răng do khả

năng sinh acid cao (chủ yếu là acid lactic), đặc biệt là trong môi trường dư thừa glucose. Chính sự acid hóa mảng bảm răng (thậm chí đến pH dưới 4,0) đã dẫn đến làm mòn men răng và gây sâu răng. Vì vậy, hoạt tính ức chế sự sinh acid của vi khuẩn được xem là một trong những thí nghiệm khởi đầu để khảo sát tác dụng bảo vệ răng của hợp chất cần quan tâm.

Trong thí nghiệm này, biofilm được đưa vào môi trường dư thừa glucose, vì thế quá trình glycolysis sinh acid bị dừng lại bởi pH thấp chứ không phải do thiếu cơ chất đường phân glucose. Hoạt tính ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans được đánh giá thông qua viê ̣c xác đi ̣nh khả năng ức chế sự giảm pH của môi trường của các tế bào S. mutans đã xử lý với các di ̣ch chiết nghiên cứu . Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 3.9. Số liê ̣u thu được cho thấy di ̣ch ^- mangostin ở các nồng độ 100M, 150 M và 200 M đã ức chế rõ rê ̣t sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans. Giá trị pH cuối cùng thu được với dịch chiết ở các

nồng đô ̣ lần lươ ̣t là : 5,05; 5,3 và 5,4 trong khi ở mẫu đối chứng (không xử lý dịch chiết ) là 4,4. Như vâ ̣y, dịch chiết -mangostintinh sạch được tại Việt Nam

cũng có khả năn g ức chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm . Nồng đô ̣ 150

M đươ ̣c lựa cho ̣n cho các thí nghiê ̣m về sau v ì đây là nồng đô ̣ có tác dụng mạnh và phù hợp hơn cho thí nghiê ̣m vì tính tan kém trong n ^{ước của} - mangostin.

Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm() Đối chứng ; () -mangostin100 M; () -mangostin150 M; ()-mangostin200 M

3.2.1.2.



Enzyme ATPase được tìm thấy ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn, có vai trò phân giải ATP và bơm proton từ tế bào chất ra bên ngoài nhằm ổn định pH nội sinh (pHi), nhờ vậy duy trì được hoạt động của các enzyme và bào quan trong nguyên sinh chất. Ở nhiều loài vi khuẩn, trong đó có S. mutans, enzyme này

đóng vai trò chìa khoá trong việc đảm bảo sự thích nghi của tế bào với điều kiện acid. Có hai loại ATPase là F-ATPase mang phức hệ protein F1-F0 nằm trên màng tế bào có vai trò tạo hoạt tính enzyme và các ATPase vận chuyển các cation như K⁺-ATPase và Na⁺-ATPase. Phần lớn hoạt tính phân giải ATP (ATPase) của S. mutans thuộc về F (H+)-ATPase trên màng. Trong số các vi

4 5 6 7 8 pH

Thời gian (giờ)

khuẩn đường miệng, S. mutans là một trong số rất ít loài có khả năng chống chịu acid cao. Vi khuẩn này vẫn có thể tiến hành quá trình đường phân ở pH thậm chí dưới 3,0. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng F-ATPase đóng vai trò chính giúp vi khuẩn S. mutans thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này [14],[15],[16].

Số liệu ở hình 3.10 cho thấy hoạt độ F-ATPase của các tế bào thấm đã bị ức chế mạnh bởi -mangostin. Ở nồng đ ộ 150M,hoạt tính enzyme đã bị ức chế >70%. Có thể kết luận rằng F-ATPase rất nhạy cảm với -mangostin.

Hình 3.10. Ảnh hƣởng của -mangostin lên hoạt độF-ATPase va_{̀ PTS của} S. mutans trên biofilm

Phospho transferase system (PTS)

Đường là nguồn carbohydrate chủ yếu của các vi khuẩn Streptococcus. Tế bào vi khuẩn này có thể đồng hoá được nhiều loại đường khác nhau như glucose, fructose, sucrose...Trước khi đi vào còn đường glycolysis, đường được hoạt hoá thành dạng glucose-6-phosphate nhờ hệ thống enzyme chuyển gốc phosphate (sugar-phosphotransferase system) viết tắt là PTS và hexokinase, trong đó hệ thống PTS đóng vai trò chính [55]. Thí nghiệm được thực hiện với tế bào thấm. Ở tế bào thấm, màng tế bào bị chọc thủng do xử lý với toluene nên tạo điều kiện

0 20 40 60 80 100 % Ứ c ch ế F-ATPase PTS

để các enzyme có thể tiếp xúc dễ dàng hơn với chất nghiên cứu. Trong thí nghiệm này, hệ thống glucose-PTS của tế bào thấm S. mutansbị ức chế bởi - mangostin . Ở nồng độ 150M, khoảng >50% hoạt tính enzyme bị ức chế (Hình 3.10). Điều đó chứng tỏ phức hệ PTS cũng nhạy cảm với -mangostin. Sự ức chế PTS có lẽ đã đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của -mangostin vì enzyme này ức chế quá trình tiếp nhận đường, khâu đầu tiên quan trọng của quá trình đồng hóa đường và sinh acid tiếp theo.

Viê ̣c ức chế các enzyme nằm trên màng tế bào cũng gợi ý màng tế bào là đích tác dụn g đầu tiên của ^{-mangostin. Rất nhiều hơ}̣p chất phenol có thể hoa ̣t đô ̣ng như là các chất hoa ̣t đô ̣ng bề mă ̣t theo kiểu không bị ion hóa (nonionic agent) can thiệp vào liên kết lipi d- protein trên màng tế bào . Nhóm hydroxyl (OH) của các chất này cũng c ó khả năng hình thành liên kết với protein và các phân tử sinh ho ̣c k hác như acid lipoteichoic trên bề mă ̣t màng tế bào . - mangostin có mang nhóm OH trong cấu trú c nên có thể có khả năng tương tác và phá hủy màng. Hơn thế nữa, tính chất không phân c ực cao của chất này gợi ý các tương tác này là có thể xảy ra với các nhóm chất ky ̣ nước trên màng tế bào . Kết quả của tương tác này là những thay đổi bao gồm cả viê ̣c phá hủy cấu trúc màng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các chất phenol có khả năng

tương tác với màng tế bào [46]. Nghiên cứu về cơ chế kháng khuẩn của thymol , một chất phenol từ thực vâ ̣t, lên hàng loa ̣t đối tươ ̣ng vi khuẩn cũng đã cho thấy chất này hoa ̣t đô ̣ng chủ y ếu theo cơ chế phá hủy màng tế bào mô ̣t cách nhanh chóng thông qua tương tác bề mă ̣t (surfactant-like action) [46]. Các kết quả nghiên cứu chư a công bố của chú ng tôi gần đây cũng khẳng đi ̣nh tác dụng này

của -mangostin trên tế ba_{̀o hồng cầu . Vì vậy, có thể khẳng định tương tác dẫn}

đến thay đổi cấu trúc màng tế bào là một trong những cơ chế tác dụng của - mangostin.

3.2.2. Đá nh giá tác d ụng ƣ́c chế sƣ̣ hình thành biofilm của vi k ^huẩn

S.mutans

3.2.2.1.



Các nghiên cứu trước đây đã cho th ấy các vi sinh vật sống trên biofilm (biofilm cells) thường có khả năng chống chịu các chất kháng khuẩn cao hơn (từ 10 tới 1000 lần) so với các tế bào sống tự do (planktonic cells) [57]. Việc loại bỏ các biofilm bằng con đường truyền thống sử dụng kháng sinh là không hiện thực vì tính chống chịu cao của các tế bào trên biofilm.Sự thích nghi cao về trao đổi chất của các tế bào này với kiểu sống trên biofilm và hơn thế nữa, có thể làm xuất hiện những chủng vi khuẩn kháng kháng sinh. Như vậy, các chiến lược hữu hiệu nhằm kiểm soát các bệnh gây ra do biofilm, trong đó có bệnh sâu răng, hiện nay đang tập trung vào việc tìm kiếm những chất kháng khuẩn có khả năng làm tổn thương hay can thiệp vào sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây bệnh.

Đánh giá ảnh hưởng của -mangostin lên sự hình thành biofilm đươ ̣c thực hiê ̣n thông qua viê ̣c nghiên cứu ảnh hưởng của nó lên sinh khối của biofilm . Sinh khối biofilm (EPS) của S. mutans trên các đĩa hydroxyapatide sau 68 giờ nuôi cấy đã được thu la ̣i để xác đi ̣nh tr ọng lượng khô và so sánh với mẫu đối chứng. Kết quả thu đư ợc cho thấy ở các nồng đô ̣ 100, 150 và 200 M, sinh khối biofilm đều giảm đi rõ rê ̣t . Đặc biệt ở nồng độ 200 ^{M, sinh khối biofilm gia}̉m tới 35% (Hình 3.11). Các số liệu này gợi ý -mangostin ảnh hưởng tới enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp bi ofilm làglucosyltransferase (GTF).

Hình 3.11. Ảnh hƣởng của -mangostin lên sinh khối biofilm cu_{̉ a} S. mutans 3.2.2.2.



Biofilm sau 68 giờ phát triển ở điều kiê ̣n có xử lý và không xử lý với - mangostin 150 µM đã đươ ̣c quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang đồng tụ quét laser. Hình ảnh biofilm thu được (Hình 3.12) cho thấy cấu trúc của biofilm đã thay đổi đáng kể ở mẫu được xử lý với nồng đô ̣ 150 ^{M so vơ}́ i đối ch ứng. Cấu trúc bi ofilm xuất hiê ̣n nhiều khoảng rỗng và các vi khuẩn l ạc (micrcolony) có vẻ to hơn so với mẫu đối chứng.

0,0 2,0 4,0 6,0 ĐC 100 150 200 -mangostin(M) Tr ọn g lƣ ơ ̣ng k h ô (m g) /b iof il m

Đối chứng -mangostin 150 M

Hình 3.12. -mangostin 150 µM làm thay đổi cấu trúc biofilm của S. mutans. Ảnh nhuộm huỳnh quang biofilm trong đó EPS có màu đỏ và vi khuẩn có màu xanh.

vi khuẩn

3.2.2.3.



Enzyme GTFở S. mutanssử dụng cơ chất sucrose để tổng hợp các glucan

ngoại bào. Những glucan này làm tăng khả năng gây bệnh của vi khuẩn nhờ việc tăng cường sự dính kết và tích luỹ các vi khuẩn trên bề mặt biofilm. Các phân tích hoá học cho thấy 40% mảng bám răng được tạo thành từ chính các glucan này [35],[36],[37]. Vì vậy, enzyme này được xem như là nhân tố quan trọng trong quátrình gây bệnh của vi khuẩn. S. mutans sản xuất 3 loại GTF chủ yếu là GTFB, xúc tác cho sự sinh tổng hợp một polymer không tan từ sucrose có chứa liên kết -1,3 glucan, GTFC sinh tổng hợp một hỗn hợp polymer tan và không tan có chứa liên kết -1,3 và 1,6 glucan và GTFD sinh tổng hợp một polymer tan có chứa liên kết -1,3 glucan [20],[56]. Kết quả nghiên cứu trình bày ở mục 3.2.2.1ở trên gợi ý ^{-mangostin ức chế sự hoạt tín h enzyme chịu trách nhiê}̣m cho sự hình thành EPS c ủa S.mutans. Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đã

nghiên cứu ảnh hưởng của chất này lên hoa ̣t đô ̣ các enzyme GTFB và GTFCở dạng hoà tan, là những enzyme đóng vai trò chủ đạo trong viê ̣c hình thành EPS không tan của vi khuẩn .

Hình 3.13. -mangostin 150 µM ức chế đến hoạt độ GTF của S. mutans

0 20 40 60 80 100 GTFC GTFB % Ứ c ch ế

Kết quả trình bày ở hình 3.13 cho thấy -mangostin ở nồng độ 150 M đã ức chế tới 83% hoạt độ GTFB và 72% hoạt độ GTFC. Số liê ̣u này ch ứng tỏ rằng các GTF là đích tác dụng của-mangostin. Đây là cơ sở để có thể sử dụng- mangostin để ngăn chặn mảng bám răng có hiệu quả.

3.3.Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin

Các nghiên cứu về biofilm đã cho thấy nó có các tính chất đặc biệt: i) bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay của vi sinh vật kẻ thù; ii) chống lại sự mất nước; iii) chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có tốc độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay trung hoà các chất kháng khuẩn; iv) nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi trường xung quanh [43]. Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm (biofilm cells) thường có khả năng chống chịu cao hơn (từ hàng 100 tới hàng 1000 lần) với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự do (planktonic cells) [57]. Các chiến lược hữu hiệu nhằm kiểm soát các bệnh gây ra do biofilm, trong đó có bệnh sâu răng, hiện nay đang tập trung vào việc tìm kiếm những chất kháng khuẩn có khả năng làm tổn thương hay can thiệp vào sự hình thành biofilm của vi khuẩn gây bệnh nhưng không làm xáo trộn hệ vi sinh vật có mặt trên mảng bám [21].

Số liệu thu đư ợc ở bảng 3 đã cho thấy ^{-mangostinkhông gây chết vi} khuẩn trên biofilm khi xử lý biofilm trong thời gian ngắn với chất này .Như vâ ̣y,-mangostinở nồng độ 150 Mức chế sự hình thành biofilm nhưng không ảnh hư ởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn . Hoạt tính kh áng biofilm của ^- mangostin dườ ng như liên quan chủ yếu đến khả năng gây ức chế hoạt tính các GTF chịu trách nhiệm cho sự hình thành biofilm của S. mutans.

Bảng 3. Độ sống sót của S. mutans trên biofilms đƣợc xƣ̉ lý với -mangostin

Biofilm CFU x 10⁸/ml

Đối chứng 2,623 ± 0,61

150 M -mangostin 2,515 ± 0,69

Có thể thấy rằng , -mangostin là chất kháng sâu răng tiềm năng vì nó tác động vào bô ̣ m áy sinh khung biofilm của vi khuẩn đồng thời ức chế enzyme chịu tr ách nhiê ̣m cho quá trìn h sinh và ch ống chi ̣u acid của vi khuẩn S. mutans.Nói một cách khác, -mangostin có đa đích tác dụng, vừa là chất chống

sự sinh acid, vừa là chất kháng biofilm (anti-biofilm agents) của vi khuẩn S. mutans.

3.4.Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm

Các chất kháng khuẩn sử dụng trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng thường có thể tích lũy trên mảng bám răng. Trong nhiều trường hợp như fluor, nồng độ tích lũy đạt tới 0,5 mM [42]. Nồng độ này thừa đủ để ức chế sự sinh acid của vi khuẩn, vì thế nó có tác dụng lâu dài ngay cả khi các sản phẩm vệ sinh răng miệng không còn được sử dụng nữa. Đây cũng là một chỉ số quan trọng để đánh giá tác dụng của một chất kháng khuẩn sâu răng tiềm năng. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi (Bảng 4) đã cho thấy -mangostin co_{́ khả năng} tích lũy trên bio film tới nồng đô ̣ 4,5 g/biofilmsau 68 giơ_{̀ nuôi cấy qua 5 lần xử} lý ngắn trong 1 phút với ^{-mangostin150 M.}

Bảng 4.Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm của vi khuẩn S. mutans

Biofilm Diện tích peak -mangostin (g/biofilm)

150 M -mangostin 29206 ± 3612,628 4,536 ± 0,01

3.4.1. Bƣớ c đầu đánh giá tác du ̣ng ch ống sâu răng của dung dịch nƣớc súc miệng có chứa α-mangostin

Dựa trên những kết quả nghiên cứu thu được ,chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm chế ta ̣o nước súc miê ̣ng có chứa -mangostin ơ_{̉ nồng đô ̣ 150} M kết hợp mô ̣t số chất hoa ̣t đô ̣ng bề mă ̣t khác , gồm các methol,tinh dầu bạc hà, NaF nhằm đánh giá khả năng ứng dụng của chất này làm nước súc miệng phòng chống sâu răng (Hình 3.14). Tác dụng của dung dịch nước súc miệng này đượ c đánh giá trên mô hình biofilm và so sánh với tác dụng của nước súc miệng Listerin thương mại về các chỉ tiêu : i) Khả năng ức chế sự sinh acid ; ii) khả năng ức chế sự hình thành

biofilm của S. mutans.

Hình 3.14. Chế phẩm nƣớc súc miê ̣ng chƣ́a α-mangostin tƣ̀ vỏ quả măng cụt

3.4.1.1. Khả năng ức chế sự sinh acid

Khả năng ức chế sự sinh a cid của vi khuẩn S. mutans được đánh giá thông qua viê ̣c xác đi ̣nh khả năng ức chế sự giảm pH môi trường của các tế bào S. mutans

trên biofilm đã được xử lý với các dung di ̣ch nước súc miê ̣ng (NSM). Kết quả trình bày ở bảng 5 cho thấy dung di ̣ch NSM ta ̣o đươ ̣c ức chế rõ rê ̣t sự sinh a cid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm . Giá trị pH cuối cùng thu được với NSM

chứa -mangostin va_{̀ Listerin lần lươ ̣t là} 5,31 và 5,60, trong khi ở mẫu đối chứng (không xử lý NSM ) là 3,99. Như vâ ̣y, khả năng ức chế sự sinh a cid của S. mutans là gần tương đương với tác dụng của dung dịch NSM thương mại

Listerin.

Bảng 5.Khả năng ức chế sự sinh a cidcủa S. mutans trên biofilm củ a các dung di ̣ch nƣớc súc miê ̣ng

Mẫu nghiên cƣ́u Giá trị pH môi trƣờng (sau 240 phút)

Đối chứng 3,99

NSM 5,31

Listerin 5,60

3.4.1.2. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm (mảng bám răng)

Nhằm tìm hiểu khả năng h ạn chế sự tạo mảng bám răng của dung di ̣ch NSM chứa ^{-mangostintạo được trên mô hình biofilm nhân t} ạo, chúng tôi đã tiến hành xử lý các biofilm của S. mutans vớ i các dung di ̣ch NSM , sau đó đo sinh khối các biofilm thu được sau 5 ngày nuôi cấy . Kết quả thu được ở bảng 6 cho