Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng
Các vi khuẩn trong mảng bám răng luôn phải đối mặt với các stress trong đó có stress acid sinh ra khi vi khuẩn tiêu thụ đường. Vậy các vi khuẩn đã sử dụng những cơ chế gì để chống chọi và thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này?
1.2.1. Bơm proton F-ATPase
F-ATPase là enzyme liên kết màng, có vai trò vận chuyển proton tạo ra sự cân bằng pH cho tế bào. Enzyme này có chứa các tiểu đơn vị liên quan đến việc cung cấp ATP cho hệ thống bơm proton qua màng và trực tiếp tạo ra ATP thông qua quá trình hô hấp của tế bào. Hệ thống bơm proton qua màng nhờ lực đẩy proton (proton-motive force) giúp thúc đẩy quá trình bơm proton từ tế bào chất ra ngoài, nhờ đó duy trì sự ổn định của pH nội bào (pHi) [16], [17], [18].
F-ATPase bao gồm 8 tiểu đơn vị, tồn tại như một tổ hợp protein liên kết với màng, có khả năng kết hợp giữa việc sản xuất ATP và vận chuyển proton [18]. Tổ hợp F0 nằm trên màng tế bào có hoạt tính vận chuyển proton bao gồm các tiểu đơn vị a, c, b. Các tổ hợp F1 liên kết với nhau theo kiểu vòng tròn bao gồm các tiểu đơn vị α, β, γ, δ và ε.F-ATPase có hoạt tính khi F1 được giải phóng khỏi màng, lúc này nó xúc tác cho quá trình vận chuyển proton kết hợp với sự sinh tổng hợp hay phân huỷ ATP. Một điều thú vị là pH tối thích của các tiểu đơn vị F1 là giống nhau, chỉ khác nhau đáng kể ở phần liên kết với F0 [14].
Không giống các vi khuẩn đường ruột có pH nội sinh (pHi) ổn định,
streptococcus có pHi thay đổi theo môi trường bên ngoài và phụ thuộc vào F- ATPase để bơm proton ra khỏi tế bào [17]. Sự khác nhau về khả năng chịu acid của các loài vi khuẩn sinh acid xoang miệng liên quan đến khả năng thấm proton. Quivey và cs [49] đã chứng minh được khả năng thực hiện đường phân và chống chịu acid của các chủng S. mutans, S. salivarius và S. sanguis phụ
thuộc chủ yếu vào việc loại proton khỏi tế bào chất nhờ F-ATPase. Các thí nghiệm với các chất kìm hãm ATPase như dicycloaxylcarbodiamide (DCCD) cho thấy sự giảm hoạt tính enzyme F-ATPase đã làm tăng tính thấm proton [54]. Như vậy, dòng proton đi vào tế bào ở pH thấp bị loại trừ nhờ bơm proton phụ thuộc ATP nằm trên màng. Giá trị pH mà tại đó khả năng thấm proton là thấp nhất khác nhau ở các loài, ví dụ S. mutans (pH 5,0); S. salivarius (pH 6,0) và
cho các loài này là 6,0; 7,0; và 8,0. Điều này phản ánh tính chống chịu acid của các vi khuẩn này và cho thấy tầm quan trọng của F-ATPase trong việc chống lại stress ở pH thấp.
Vi khuẩn Streptococcus không có chuỗi hô hấp nên không có khả năng sử dụng phức hệ F1-F0 để tổng hợp ATP thông qua con đuờng phosphoryl hoá-oxy hóa [37]. Do đó, vai trò duy nhất của phức hệ trong các vi khuẩn này là bơm H+
ra ngoài để thiết lập trạng thái cân bằng pH. Tầm quan trọng của phức hệ F1-F0
đã được chứng minh bằng việc tạo ra các đột biến nhạy cảm acid ở pH 6,0 do bị thiếu hụt phức hợp này [37]. Rõ ràng khả năng tạo ATP nhờ F-ATPase ở pH thấp có ý nghĩa cơ bản cho sự sống sót của vi khuẩn ở pH thấp cho đến khi pH môi trường tăng lên [28].
1.2.2. Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid
Các nghiên cứu về sinh lý của vi khuẩn xoang miệng đã chứng minh rằng màng tế bào đóng một vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà acid-base [15],[22]. Vai trò này bao gồm việc bơm proton ra khỏi tế bào và loại bỏ proton khỏi môi trường. Nhờ vậy khi các vi khuẩn sản xuất nhiều acid hay ở trong môi trường acid thì pHi ở tế bào chất luôn cao hơn pH ở môi trường bên ngoài. Sự chênh lệch pH qua màng là điều kiện sống còn cho hoạt động của các hệ thống nhạy cảm acid của tế bào như hệ thống đường phân.
Các nghiên cứu của Bender và cs [18], Chang và Cronan [25] và sau đó của Ma và cs [39] đều cho thấy tính thấm proton của màng tế bào streptococci
giảm đi khi tế bào thích nghi với điều kiện pH thấp. Như vậy, trong quá trình thích nghi này, màng tế bào đã có những điều chỉnh nhằm đáp ứng lại những tác động bất lợi của stress acid. Sự điều chỉnh này đã được Fozo và Quivey phát hiện khi nghiên cứu thành phần acid béo trên màng tế bào sinh trưởng trong điều kiện pH thấp [48]. Chủng S. mutans sinh trưởng ở pH 5,0 có thành phần acid
béo bão hoà tăng lên và các chuỗi acid béo cũng dài hơn so với khi sinh trưởng ở pH 7,0. Trái lại, chủng S. mutans không thích nghi tốt với stress acid thì ít có
khả năng thay đổi thành phần màng tế bào. Điều này gợi ý rằng việc tạo ra những acid béo mạch thẳng C14:0 và C16:0 cũng như sự giảm C18:0 liên quan đến sự thích nghi acid và có thể có vai trò làm tăng khả năng chống chịu với các chất diệt khuẩn cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn ở pH thấp.
Các protein trên màng cũng góp phần vào việc duy trì tính ổn định của màng tế bào ở pH thấp. Đột biến S. mutans AS17 nhạy cảm acid được tạo ra nhờ đưa vào bộ gen vi khuẩn đoạn gen Tn917. Kiểu hình này nhạy cảm với acid là do gen ffh (fifty-four homologue) bị thay đổi [33]. Gen này mã hoá protein Ffh, có trọng lượng phân tử 54 kDa và giống với tiểu phần nhận biết tín hiệu SRP (signal recognition particle) của sinh vật nhân chuẩn. Protein này tham gia vào quá trình vận chuyển protein và sinh tổng hợp màng. Chủng đột biến ffh bị giảm đáng kể khả năng sinh tổng hợp enzyme F-ATPase, không có khả năng lên men sorbitol và không thể sinh trưởng ở pH 5,0 [33]. Kết quả này chứng tỏ các protein trên màng có vai trò bảo vệ tế bào ở điều kiện pH thấp.
1.2.3. Sự sinh các chất kiềm
Một trong các cơ chế giúp vi khuẩn xoang miệng có thể sống sót trong điều kiện stress acid là khả năng sinh amoniac để trung hoà acid trong tế bào chất và môi trường bên ngoài [23]. Ba con đường chính mà các vi khuẩn sử dụng để tạo amoniac là: urease, arginin deiminase (ADS) và agmatin deiminase (AgDS). NH3 được tạo ra thông qua các con đường này ngay lập tức kết hợp với các proton có trong tế bào chất hay được vận chuyển qua màng tế bào và kết hợp với các proton ở môi trường bên ngoài để hình thành NH4+, nhờ đó làm tăng pHi nội bào hay pH của môi trường bên ngoài. Điều này làm tăng tính chống chịu acid của vi khuẩn.
1.2.3.1. Urease
Urease là enzyme có cấu trúc bậc 4 chứa Ni trong trung tâm hoạt động. Enzyme này thủy phân ure thành 2 phân tử amoniac và một phân tử CO2. Ở nước bọt của người khoẻ mạnh, hàm lượng urease đạt từ 3 – 10 mM [34].
Urease có hoạt tính cao nhất ở pH 7,0, còn khoảng 80% hoạt tính ở pH 5 - 5,5, nhưng dễ mất hoạt tính ở các pH quá cao hoặc thấp và mất hoàn toàn hoạt tính ở pH 4,3. Ở pH thấp (pH 5,5), mức độ biểu hiện của enzyme này trong tế bào tăng lên tới 600 lần so với tế bào phát triển ở pH 7,0. Điều này được chứng minh khi phát hiện thấy mức độ thay đổi ARNtt đặc hiệu urease cũng phụ thuộc pH. Việc loại bỏ hệ thống tiếp nhận đường phospho transferase system (PTS) phụ thuộc glucose đã làm giảm hoạt độ của urease tới 20 lần. Như vậy có mối liên quan giữa PTS, sự đồng hoá đường và sự điều hoà hoạt tính urease. Mức độ ARNtt đặc hiệu urease liên quan chặt chẽ với pH đã chứng tỏ urease được điều hoà ở mức độ phiên mã [26].
1.2.3.2. Hệ thống arginin deiminase (ADS)
Arginin deiminase được mã hoá bởi arc, nằm trong con đường đa enzyme xúc tác sự chuyển hoá arginin thành ornitin, amoniac, CO2 đồng thời tạo ra ATP. Arginin deiminase phổ biến rộng rãi ở các vi khuẩn nhân sơ và cấu trúc bậc một của enzyme này cũng có tính bảo thủ cao [24], [29].
ADS được phát hiện ở nhiều vi khuẩn xoang miệng như S. gordonii, S. rattus, S. sanguis và nhiều loài lactobacillus [12],[30], [31], [32]. Các vi khuẩn
này có thể sử dụng Arg ở trạng thái tự do, trong các liên kết peptit hay trong protein của nước bọt [51]. ADS có vai trò quan trọng trong chống chịu acid của các vi khuẩn, đặc biệt là những loài ít có khả năng chịu acid. ADS có thể tạo NH3 ở pH dưới ngưỡng cần cho sự phát triển hay cần thiết để tiến hành đường phân. NH3 hình thành trong tế bào chất sẽ lập tức kết hợp với proton để tạo thành NH4
+
làm tăng pHi, vì vậy có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nhạy cảm với acid trong tế bào chất [29]. Chính điều này giúp các vi khuẩn có thể sống sót được trong mảng bám răng, nơi có nhiều chủng vi khuẩn khác có khả năng chịu acid cao hơn. Trong số các vi khuẩn xoang miệng có ADS thì S. gordonii là một
trong số vi khuẩn có mặt phổ biến nhất, xuất hiện sớm trên mảng bám răng và là thành viên chủ yếu trong mảng bám quanh lợi ở người khoẻ mạnh. Sự định cư
của nó có lẽ đã ngăn cản sự xâm chiếm của những loài vi khuẩn chịu acid gây sâu răng khác [30].
Mức độ cảm ứng của hệ thống ADS tăng lên ở pH acid đã phản ánh tầm quan trọng của nó. Ví dụ mức độ này tăng tới 48 lần ở S. rattus, 1467 lần ở S. sanguis và hơn 300 lần ở S. gordonii. Ở phần lớn vi khuẩn, ADS được cảm ứng
bởi arginine và bị kìm hãm bởi glucose [50].