Nakatami và cs [45] đã chứng minh được γ-mangostin trong măng cụt là chất ức chế mạnh của COX (cyclooxgenase)-2. Enzyme COX-2 là tác nhân gây viêm trong cơ thể người. Các enzyme này thường có mặt ở các bệnh nhân bị đau khớp hay bị viêm khớp. Các tác giả đã phát hiện thấy chất này làm giảm rõ rệt sự hình thành enzyme COX-2. Hội chứng viêm kinh niên là một trong những căn nguyên hàng đầu dẫn đến bệnh tiểu đường tuýp 2, các chất xanthone có thể giúp ngăn ngừa bệnh này thông qua việc làm giảm và điều hòa lượng đường trong máu, tăng sinh lực cho cơ thể người bệnh.
1.3.4.5. Hoạt tính chống ung thư
Hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau. Sato và cs [52] khi nghiên cứu tác dụng gây apoptosis của 8 dẫn xuất xanthone khác nhau trên tế bào ung thư ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột đã phát hiện thấy các dẫn xuất này đều có tác dụng gây ra hiện tượng apoptosis nhưng α-mangostin có tác dụng mạnh nhất. Nhóm nghiên cứu của Ho [33] lại phát hiện thấy garcinone-E có hoạt tính diệt mạnh các tế bào ung thư người thuộc các dòng ung thư dạ dày, phổi và gan. Đặc biệt, Matsumoto và cs [42] khi nghiên cứu tác dụng của 6 xanthone khác nhau từ vỏ quả măng cụt lên sự phát triển của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đã thu được một kết quả hết sức thú vị là tất cả các dẫn xuất xanthone nghiên cứu đều có tác dụng ức chế, trong đó α-mangostin có hoạt tính ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10µM thông qua con đường apoptosis.
Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy rằng các dẫn xuất xanthone từ măng cụt có tác dụng ức chế có hiệu quả sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau và có thể nói các chất này có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư.
Việt Nam là nước trồng măng cụt nhiều. Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú để tinh sạch, nghiên cứu tác dụng sinh học và khả năng ứng dụng của các chất xanthone, đặc biệt là hoạt tính kháng biofilm .Cơ chế sâu về tác dụng kháng biofilm của chất này cũng như tiềm năng ứng dụng của nó là vấn đề rất hấp dẫn, cần phải được làm sáng tỏ.
2.1. Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy
Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 là quà tặng của GS . Robert E. Marquis, Khoa Vi sinh và Miễn dịch học, Trường Đại học Rochester, Hoa Kỳ. Đây là chủng vi khuẩn có lý lịch rõ ràng, thường được các phòng thí nghiệm quốc tế sử dụng trong các nghiên cứu về sâu răng. Chủng này được giữ và cấy chuyển hàng tuần trên môi trường tryptic soy agar (TSA) của hãng Difco (Hoa Kỳ). Vi khuẩn được nuôi cấy ở 37oC trong môi trường chứa 3% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men và 1% glucose (TYG).
2.2. Nguyên liệu thực vật
Vỏ quả măng cụt được thu mua từ các chợ ở Hà Nội và được GS.TS. Phan Kế Lộc giúp định tên khoa học là Garcinia mangostanaL.. Nguyên liệu
được sấy khô trong tủ ấm ở 60o
C, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu : 3 thể tích dung môi. Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo.
2.3. Hóa chấtvà thiết bị Hóa chất Hóa chất
- Các thành phần môi trường được sử dụng trong việc nuôi cấy vi sinh vật bao gồm tryptone, dịch chiết nấm men, cao thịt bò, peptone (Difco, Mỹ).
-Bản silica gel tráng sẵn 60 F254 25 , tấm nhôm (20 x 20 cm) của hãng Merk (Đức).
- Silica gel (Grade 7734, 63-200 μm 70-230 mesh).
- Các chất nhuộm huỳnh quang Alexa Fluor® 647-và SYTO®9 green đươ ̣c mua từ hãng Invitrogen (Mỹ).
- Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc.
- Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết cho phân tích.
Thiết bị
- Máy ly tâm
- Máy đo quang phổ - Máy đo pH
- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng - Box cấy laminare
- Máy quay cất khô chân không
- Kính hi ển vi huỳnh quang quét laser
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phƣơng pháp nghiên cứu tế bào
2.4.1.1. Chuẩn bị dịch tế bào
Dung dịch tế bào được chuẩn bị trong dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM pH 7,0 với mật độ khoảng 109 tế bào/ml. Dịch tế bào được pha loãng trong dung dịch peptone 1% ở các mật độ nhỏ dần 10 lần và được cấy trải trên đĩa thạch TSA, nuôi ở 37C cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt và có thể đếm bằng mắt thường [10].
2.4.1.2. Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop)
Khả năng sinh acid của tế bào được đánh giá thông qua việc làm giảm pH của môi trường bên ngoài dẫn đến sự tụt pH (pH drop). Các giá trị pH tại mỗi thời điểm nghiên cứu nhất định được đo bằng máy đo pH.
Sau khi thu tế bào từ biofilm bằng cách ly tâm 6000 gở 40C trong 15 phút, tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM.Sau đó, tế bào được hòa trở lại trong dung dịch muối này ở mật độ khoảng 5 x 109 CFU/ml, tương đương 2 mg trọng lượng khô tế bào/ml. pH của dịch tế bào được chỉnh đến 7,2 bằng KOH 1M. Glucose được bổ sung vào để đạt nồng
độ cuối cùng là 0,04%, đảm bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân. Sự giảm pH môi trường do sự sinh acid trong quá trình đường phân được theo dõi sử dụng máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức [10].
2.4.2. Các phƣơng pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme
2.4.2.1. Chuẩn bị tế bào thấm
Tế bào S.mutans được thu hoạch từ biofilm sau 68 giờ nuôi cấy . Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Cặn tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM, sau đó tế bào được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM. Sau khi thêm toluene (tỉ lệ 1 : 10 thể tích), dịch tế bào được trộn đều và ủ ở 370
C trong 5 phút. Tế bào nhanh chóng đươ ̣c làm đông lạnh trong hỗn hợp đá khô với ethanol trong 1 phút. Ngay sau đó, dịch tế bào được làm tan ở 370C trong 5 phút. Chu kỳ này được lặp lại 2 lần. Toluene được loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút. Tế bào thấm được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM và được cất giữ ở -700C đến khi dùng [10].
2.4.2.2. Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS)
Hoạt động của hệ thống ezyme chuyển hóa đường (PTS) được xác định theo phương pháp của Belli và Marquirs [16]. Phản ứng được thực hiện với tế bào thấm. Hoạt độ của enzyme được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành là pyruvate từ phosphoenolpyruvate, là sản phẩm trung gian khi tế bào tiêu thụ glucose. Pyruvate tạo thành được xác định bằng enzyme lactate dehydrogenase trong sự có mặt của NADH. Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm Tris – malate 50 mM (có chứa MgCl2 20 mM, NAF 1 mM và glucose 40 mM, pH 7,0), MgCl2 10 mM, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, ADP và tế bào thấm. Phản ứng được bắt đầu bằng việc thêm vào hỗn hợp phản ứng phosphoenolpyruvate (PEP) 10 mM. Đo độ hấp thụ tại A340.
Một đơn vị hoạt độ PTS là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 1µmole pyruvate thành lactate trong 1 phút, tương ứng với 1µmole glucose được phosphoryl hóa trong 1 phút ở điều kiện phân tích.
2.4.2.3. Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase
ATPase được xác định với tế bào thấm theo phương pháp của Sturr và Marquis [55]. Hoạt động của enzyme được xác định thông qua việc đo lượng phospho vô cơ được giải phóng ra sử dụng thuốc thử Beccini. Thuốc thử này có chứa ZnCl2 100mM và amonium molybdate 15mM. Hỗn hợp phản ứng enzym có chứa đệm Tris – malate 100 mM, pH 7,0, MgCl2 10 mM và tế bào thấm. Phản ứng được bắt đầu bằng việc bổ sung ATP 5 mM. Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp này được ly tâm với tốc độ 6.000 g ở 40C trong 15 phút. Phần dịch trên kết tủa được trộn đều với thuốc thử Beccini và đo độ hấp thụ ở A350. Lượng phospho trong mẫu nghiên cứu được tính dựa vào đồ thị chuẩn sử dụng dung dịch phospho chuẩn (Sigma).
Một đơn vị hoạt độ ATPase là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1 µmole phospho vô cơ trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.
2.4.2.4. Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF)
Hoạt độ GTF được xác định theo phương pháp của Koo và cs [35]. GTFB và GTFC thu được từ những chủng tế bào tái tổ hợp mang gen sinh tổng hợp chỉ một loại enzyme này. Chủng S. milleri KSB8 mang gen gtfB lấy từ chủng S. mutans GS-5. Chủng S. mutans WHB 410 có các gen gtfB và gtfD đã bị cắt bỏ
chỉ còn gen gtfC. Các enzyme GTFB và GTFC là những chế phẩm enzyme tinh
sạch đến mức gần đồng nhất, sử dụng cột sắc ký hydroxyapatite theo phương pháp của Venkitaraman và cs [56]. Trong thí nghiệm ở đây, các enzyme GTFB và GTFC được Koo H. (Trung tâm Sinh học Xoang miệng, Đại học Rochester, Hoa Kỳ) cung cấp.
Một đơn vị hoạt độ enzyme GTF là lượng emzym cần thiết để kết hợp 1,0 mol glucose vào glucan trong 4 giờ phản ứng ở điều kiện thí nghiệm.
Hoạt độ enzyme được xác định đối với enzyme ở trạng thái enzyme hoà tan trong dung dịch. Các enzyme GTFC và GTFB được trộn đều với chất nghiên cứu và được ủ với cơ chất [14C-glucose]- sucrose. Hỗn hợp phản ứng bao gồm cơ chất 0,2 Ci/ml, sucrose 200 mM, dextran 9000 40 mM, Na3N 0,02% và đệm hấp phụ có chứa KCl 50 mM, KHPO4 1,0mM, CaCl2 1,0 mM và MgCl2 0,1mM, pH 6,5. Mẫu đối chứng có chứa các thành phần tương tự chỉ khác là chất nghiên cứu được thay thế bằng ethanol. Hỗn hợp phản ứng được lắc liên tục trong 4 giờ ở 37o
C sau đó 1 ml ethanol lạnh được thêm vào để dừng phản ứng. Quá trình kết tủa glucan được thực hiện trong vòng 18 giờ ở 4oC. Các glucan có mang glucose đánh dấu được xác định bằng máy đếm nhấp nháy lỏng (Hoa Kỳ).
2.4.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu về biofilm
2.4.3.1. Tạo biofilm
Biofilm (mô hình bắt chước mảng bám răng) được hình thành trên các lam kính và trên các đĩa hydroxyapatite có đường kính 0,5 cm (Clarkson Chromatography Products Inc . Hoa Kỳ ) (Hình 2.1). Môi trường cho nuôi cấy tế bào biofilm có chứa tryptone 3%, dịch chiết nấm men 0,5% và sucrose 1%. Biofilm được thu hoạch sau 68 giờ nuôi cấy . Để tách rời các tế bào khỏi màng biofilm, các màng này đư ợc tách khỏi giá thể vào trong dung dịch NaCl 0,89% và sau đó đư ợc làm đồng nhất bằng máy nghiền đồng thể và máy siêu âm (Branson sonifier 150, Hoa Kỳ ). Biofilm đươ ̣c xử lý với chất nghiên cứu 2 lần/ngày, cách nhau 8 tiếng trong thời gian 1 phút. Trong mô ̣t số thí nghiê ̣m , biofilm cũng được ta ̣o trên nền giá đỡ là lam kí nh thủy tinh có kích thước 3 x 12 cm vớ i một quy trình tương tự [10], [35],[37].
Đĩa hydroxyapatite Giá đỡ biofilm Đĩa nuôi cấy biofilm
Hình 2.1. Mô hình ta ̣o biofilm S. mutans trên bề mặt đi ̃a hydroxyapatite
2.4.3.2. Xác định thành phần biofilm
Sau 5 ngày nuôi cấy, biofilm được thu hoạch, siêu âm và dùng để đánh giá: i) Sinh khối biofilm: được thu lại sau khi ly tâm 10.000 g trong 10 phút ở
4oC. Phần tủa được rửa 2 lần với nước cất loại ion và xác định trọng lượng khô;
ii) Độ sốngcủa tế bào trên biofilm: được xác đi ̣nh bằng cách cấy trải tế bào trên biofilm lên đĩa tha ̣ch TSA.
2.4.3.3. Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sẽ đánh giá sinh khối biofilm (biomass) và sự phân bố các thành phần EPS và vi khuẩn trong các biofilm sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang đánh dấu in situ đặc hiệu kết hợp với phân tích hình ảnh trên kình hiển vi huỳnh quang đồng tụ quét laser (LSCFM). Phương pháp này cho phép phân tích định tính và quan sát được các tế bào vi khuẩn và thành phần EPS, qua đó kiểm tra chính xác được cấu trúc biofilm. Đánh dấu in situ EPS được thực hiện như sau: phức hợp dextran đánh dấu Alexa Fluor® 647-(10,000 MW; Molecular Probes Inc., Eugene, OR) được thêm vào môi trường nuôi cấy trong quá trình phát triển của biofilm. Dextran đánh dấu huỳnh quang đóng vai trò như là 1 primer cho các enzyme GTF và được kết hợp một cách tự động vào khung EPS trong quá trình hình thành biofilm nhưng không nhuộm tế bào vi khuẩn ở nồng độ sử dụng này. Vi khuẩn trong biofilm được đánh dấu với chất nhuộm acid nucleic SYTO® 9 green (480/500 nm; Molecular Probes Inc., Eugene, OR). Hình ảnh của biofilm được quan sát sử
dụng kính hiển vi LSCFM. Mỗi biofilm được quét 5 lần tại một vị trí lựa chọn. Cấu trúc 3 chiều của biofilm được phân tích dùng phần mềm Amira™ 4.1.1 (Chelmsford, MS, USA)[37].
2.5. Đánh giá sƣ̣ tích lũy của α-mangostin trên biofilm
Biofilm được thu hoa ̣ch sau 68 giờ nuôi cấy. Sinh khối biofilm đươ ̣c thu lại bằng cách siêu âm và ly tâm ở 9.500gtrong 10 phút ở 4oC. Tủa biofilm được rửa 2 lần với nước loa ̣i ion . -mangostin được phản hấp phụ bằng viê ̣c rửa với 100% ethanol (Sigma). Hàm lượng -mangostin trên mỗi biofilm đ ược đo bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (Alliance series 2695, detector PDA 2996 Waters, US). -mangostin thương mại 96% (ChromaDex) đươ ̣c sử dụng như là chất chuẩn. Các thông số đ ược sử dụng trên c ột HPLC là: column: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm, phase di động: H2O thêm 0,1% formic acid (channel A) và Acetonitrile (channel B), flow rate: gradient 1ml/min, detector PDA: 315 nm.
2.6. Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S. mutans từ vỏ quả măng cụt
2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn có độ dày 1mm (60 F254, Merck). Các hệ dung môi phân tích được sử dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2: 1; ii) Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ 3:1. Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng. Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi NH3.
Sắc ký cột silica gel
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Đối với sắc ký cột:
- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột có kích thước được tính toán dựa trên lươ ̣ng mẫu sẽ na ̣p lên cô ̣t .
- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rử a cô ̣t .
Trong thí nghiê ̣m này , phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi h ạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hê ̣ dung môi đã lựa cho ̣n với các bư ớc gradient khác nhau. Các phân đoạn tinh sạch sau đó được kiểm tra đô ̣ sa ̣ch bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cô ̣ng hưởng từ hạt nhân 1
HNMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).
2.6.2. Phân tích cấu trúc hó a học bằng cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ). Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ