Chƣơng 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.6.Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S.mutans từ vỏ quả măng cụt
2.6.1. Tách các hợp chất polyphenol bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Việc phân tích được thực hiện trên các bản sắc ký đã được chuẩn bị sẵn có độ dày 1mm (60 F254, Merck). Các hệ dung môi phân tích được sử dụng gồm có: i) Toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5: 3: 2: 1; ii) Hexane: acetone theo tỉ lệ 3:1 và 2:1; iii) Hexane: ethyl acetate theo tỉ lệ 3:1. Sau khi chạy sắc ký xong, bản sắc ký được làm khô ở nhiệt độ phòng. Màu sắc các vạch được quan sát dưới ánh sáng thường hoặc xông hơi NH3.
Sắc ký cột silica gel
Sắc ký là phương pháp tách, phân li, phân tích các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa pha động và pha tĩnh. Đối với sắc ký cột:
- Pha tĩnh: là chất rắn, thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể được nạp nén vào trong một cột có kích thước được tính toán dựa trên lươ ̣ng mẫu sẽ na ̣p lên cô ̣t .
- Pha động: là chất lỏng, được gọi là dung môi rử a cô ̣t .
Trong thí nghiê ̣m này , phân đoạn chứa chất quan tâm được phân tách trên các cột sắc ký nhồi h ạt silica có kích thước 70 - 230 mesh (Merck) sử dụng hê ̣ dung môi đã lựa cho ̣n với các bư ớc gradient khác nhau. Các phân đoạn tinh sạch sau đó được kiểm tra đô ̣ sa ̣ch bằng sắc ký lớp mỏng và đo phổ cô ̣ng hưởng từ hạt nhân 1
HNMR, 13C NMR (Bruker Avance - 500, Hoa Kỳ).
2.6.2. Phân tích cấu trúc hó a học bằng cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Đối với phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân, chất nghiên cứu sau khi được đưa vào vùng từ trường Bo sẽ bị tách thành những proton có các mức năng lượng khác nhau từ thấp đến cao. Sự khác nhau này được phản ánh thông qua tần số cộng hưởng. Tần số này được ghi lại dưới dạng các phổ proton, carbon, HMBC, HPQC, COSY, NOESY nhờ máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker, Avance 500 (Hoa kỳ). Dựa vào độ dịch chuyển của các proton khi giải các phổ trên sẽ xác định được số nguyên tử C, H cũng như những nhóm chức có thể tham gia vào bộ khung carbon. Kết hợp với những số liệu thu được từ máy đo khối phổ sẽ cho phép xác định cấu trúc hoá học của chất cần nghiên cứu.