3.1. Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt 3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt 3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt
Các nghiên cứu trước đây đã phát hiện thấy cây măng cụt, đặc biệt là vỏ quả và vỏ cây, chứa nhiều hợp chất phenol nhất là nhóm chất xanthone trong đó
có -mangostin [1],[7]. Đến nay, đã có hơn 60 dẫn xuất xanthone khác nhau
trong măng cụt được tinh sạch và xác định cấu trúc (Dictionary of Natural Products - DNPonCD-Rom). Mặc dù đã tr ở thành chế phẩm hóa chất thương mại trong thời gian gần đây , nhưng giá thành c ủa chất này còn rất cao (150 USD/ 10 mg–Sigma).Trong khi đó, viê ̣c nghiên cứu sâu cũng như ứng dụng đòi hỏi cần một lượng chất lớn . Vì thế, việc tách và tinh sạch chúng từ nguồn nguyên liệu tự nhiên là cần thiết .
Để tinh sạch các xanthone, phần lớn các phòng thí nghiệm đều bắt đầu bằng việc sử dụng dịch chiết với ethanol hay methanol. Các xanthone sẽ được tinh sạch từ các dịch chiết này bằng phương pháp sắc ký trên các cột silica gel sử dụng các hệ dung môi hữu cơ có tỉ lệ phân cực khác nhau để đẩy dần các chất này ra khỏi cột. Nhìn chung, để tinh sạch được một chất xanthone phải sử dụng thêm nhiều phương pháp sắc ký khác như sắc ký ngược pha, sắc ký trên cột sephadex LH-20, nên rất phức tạp và tốn kém. Nguyễn Thị Mai Phương và cscũng đã tách được α-mangostin từ dịch chiết ethanol của vỏ quả măng cụt sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi toluene: ethyl acetate: acetone: formic acid (TEAF) theo tỉ lệ 5:3:1:1 [10]. Tuy vậy, qui trình tách chiết chất này tỏ ra không hiệu quả mặc dù khá đơn gi ản vì hiệu suất thu hồi sản phẩm rất thấp. Các tác giả này cũng phát hiện thấy rằng các chất phenol có hoạt tính sinh học quan tâm là những chất có hệ số Rf lớn, nằm trong khoảng từ 8,0 đến 9,0 đồng nghĩa với việc chúng có tính phân cực thấp. Nhóm nghiên cứu này
sau đó đã đơn gi ản hóa quá trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt bằng cách sử dụng những phân đoạn chiết trong dung môi hữu cơ có độ phân cực thấp như toluene, chloroform hay n-hexane nhằm loại bỏ phần lớn các chất không mong muốn khác có trong nguyên liệu ban đầu. Dung môi n -hexane đã được lựa chọn vì nó có điểm sôi thấp hơn (61o
C) so với chloroform hay toluene (>100 oC) và cũng có hằng số lưỡng điện (dielectric constant) rất thấp (1,89 so với 4,81 của chloroform và 2,38 của toluene). Nhờ vậy, qui trình tinh sạch này đã có hiệu suất caohơn . Nhóm tác giả đã tinh sạch -mangostin sử dụng quy trình gồm các bước : i) tách chiết phân đoạn trong n-hexane; ii) sắc ký phân đoa ̣n cao chiết n-hexane trên 2 cô ̣t silica gel liên tiếp sử dụng h ệ dung môi rửa chiết n- hexane : ethyl acetate : methanol vớ i gradient dung môi có tính phân c ực giảm dần. Bằng quy trình này , -mangostin đã được tinh sạch hoàn toàn với hiệu suất thu hồi đạt 0,013% và đ ộ sạch đạt >98% [11]. Hiệu suất này cao hơn nhiều so với qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng đã thực hiê ̣n trước đây [10]. Tuy nhiên, có thể thấy quy trình đ ược đưa ra vẫn chưa đa ̣ t hiê ̣u quả cao so với các quy trình đã được các tác giả khác công bố [10].
Với mục đích tìm ra đ ược quy trình tinh sa ̣ch -mangostin tối ưu hơn , trong nghiên cứu này , chúng tôi đã tiến hành tinh sa ̣ch -mangostin từ phân đoạn chiết n-hexane sử dụng cô ̣t sắc ký sil icagel với hê ̣ dụng môi rửa c hiết được thay đổi. Cụ thể như sau:
Bột nguyên liệu vỏ quả măng cụt khô (2,0 kg) đã tiến hành chi ết rút với ethanol bằng phương pháp ngâm chiết theo tỉ lê ̣ 1 nguyên liê ̣u : 3 thể tích ethanol trong 3 ngày để thu cao ethanol tổng số . Ethanol đã được kh ẳng đi ̣nh là dung môi phù hơ ̣p nhất để chiết r út polyphenol từ vỏ quả măng cụt xét về tiêu chí hiệu suất thu hồi cao chiết và hiê ̣u quả kinh tế của quy trình thu nhâ ̣n . Quá trình chiết này được lặp la ̣i 3 lần. Dịch chiết s au đó được cô cất quay để thu cao ethanol tổng số.Khối lươ ̣ng cao ethanol tổng số thu đươ ̣c từ thí nghiê ̣m này là 153,6 g.
Để thu nhâ ̣n phân đoa ̣n chiết n -hexane, cao ethanol tổng số đươ ̣c hòa vào nước và tiến hành chiết p hân đoa ̣n với n -hexane trong phễu chiết . Phần phân đoa ̣n n-hexane sau khi thu được quay cất khô chân không và cân để đi ̣nh lượng phân đoa ̣n thu đươ ̣c . Trong thí nghiê ̣m này , lượng cao phân đoa ̣n n -hexane thu được là 8,2 g chiếm 0,41% so với khối lượng ban đầu .
Độ sạch của phân đoạn n-hexane được kiểm tra bằng phương pháp TLC trên silica gel (Hình 3.1) sử dụng hệ dung môi n-hexane : acetone theo tỉ lệ 3:1 với chất chuẩn -mangostin (ChromaDex) làm đối chứng . Kết quả thu được 9cho thấy phân đoạn n -hexane có chứa -mangostin và có độ sạch tăng lên rõ rệt so với di ̣ch chiết tổng số trong ethanol (Hình 3.1).
Hình 3.1. Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n- hexane sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi hexane: acetone (3:1).1. Chất chuẩn ; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân
đoạn chiết n-hexane.
3.1.2. Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt
3.1.2.1. Lựa chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắc ký silica gel
Để tinh sạch thành công chất nghiên cứu bằng phương pháp sắc ký thì viê ̣c chọn lựa được hê ̣ dung môi sắc ký thích hợp là hết s ức quan tro ̣ng. Dựa trên kinh
nghiê ̣m và tham khảo c ác nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã kiểm tra khả năng phân tách phân đoa ̣n n -hexane trên TLC sử dụng 3 hê ̣ dung môi là hexane : ethyl acetate (2:1); hexane: ethyl acetate (3:1) và h exane: acetone (3:1). Kết quả thu được cho thấy hê ̣ dung môi h exane: acetone (3:1) là phù hơ ̣p nhất để tinh sa ̣ch
-mangostin từ phân đoa ̣n n-hexane.
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng trong hệ dung môi: A) hexane: ethyl acetate (2:1); B) hexane: ethyl acetate (3:1); C) hexane: acetone (3:1).1. Chất chuẩn ; 2. Phân đoạn chiết ethanol; 3. Phân đoạn chiết n-hexane.
3.1.2.2. Tinh sạch -mangostin trên cột sắcký silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1)
Phân đoạn n-hexane có khối lượng khoảng 8,2 g được đưa lên cột sắc ký silica gel có kích thước 3 x 80 cm và được rửa chiết với hệ dung môi n-hexane: acetone tỉ lê ̣ 3:1 (v/v). Sau khi thu các phân đoạn 10ml, độ sạch của các phân đoa ̣n được xác định bằng TLC kết hơ ̣p so sánh với chất chuẩn. Kết quả cho thấy -mangostin được rử a ra khỏi cô ̣t ở phân đoa ̣n t ừ 30 đến 42 (Hình 3.3). Các phân đoa ̣n này sau đó được dồn lại và đông khô để xác định độ sạch , hiê ̣u suất của quy trình thu nhận .Kết quả cho thấy sắc ký đồTLC chỉ còn một băng duy nhất khi sử dụng cả hai hê ̣ dung môi cha ̣y TLC kh ác nhau là TEAF (5:3:1:1) và
1 2 3 1 2 3 1 2 3
Hexane: acetone (3:1). Điều này chứng tỏ chất thu được đã được tinh sạch(Hình 3.4). Quy trình này đã cho phép thu được 1,3 g chất tinh sa ̣ch vớihiệu suất đạt 0,06%, cao hơn khoảng 5 lần so vớ i quy trình đã đươ ̣c công bố trước đây [11].
Hình 3.3. Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1)
Hình 3.4A. Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch tƣ̀ v ỏ quả măng cụt với hệ dung môi hexane: acetone (3:1 v/v).
1. Chất chuẩn; 2. Chất tinh sạch.
Hình 3.4B. Sắc ký đồ α- mangostin tinh sa ̣ch tƣ̀ v ỏ quả măng cụt với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1 v/v)
0-35 40-80 80-95
1 2
Rf0,82 Rf0,85
Sắc ký lỏng hiê ̣u năng cao HPLC kết hợp với khối phổso sánh với mẫu α- mangostinchuẩn cho thấy còn mô ̣t đỉnh chính với thời gian lưu là 18,72 phút vàđô ̣ sa ̣ch đa ̣t tương đương với chất chuẩn >83,3% chỉ sau mô ̣t lần sắc ký (Bảng 2, hình 3.5) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.5. Phổ HPLC của chất tinh sạch (A) so với chất chuẩn (B) sau khi qua các cột sắc ký silica gel đo trên máyWaters Alliance 2695 – PDA 2996(Xem phụ lục)
A
Bảng 2. Độ sạch của chế phẩm α-mangostin so với chất chuẩn
Để khẳng định chính xác chất tinh sạch được chính là -mangostin chúng tôi đã tiến hành đo và phân tích phổ 1H và 13
C của chất thu được trên máy cộng hưởng từ hạt nhân.
Hình 3.6. Phổ Proton (A) và 13C (B) của chất -mangostin đo trên máy NMR Bruker, Avance 500
Số liệu thu được trên hình 3.6 đã khẳng định đây chính là -mangostin, có công thức hóa học là C24H26O6, có cấu trúc của một xanthone điển hình (hình 3.7) và trọng lượng phân tử là 410.
Hình 3.7. Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6). A. Cấu trú c hóa
học; B. Sản phẩm thu nhận được sau khi tinh sạch qua cột sắc ký
Toàn bộ qui trình tinh sạch -mangostin được tóm tắt trong sơ đồ ở hình 3.8.
Hình 3.8. Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt
O H O H O O O O H A B Cặn Ethanol Phân đoạn H2O Phân đoạn n-hexane (8,3g)
Sắc ký cột silica gel Phân tích HPLC-MS Phân tích NMR α-mangostin (1,3 g) Ethanol H2O Bột vỏ quả măng cụt (2000 g)
Như vậy, sử dụng phương pháp tách chiết phân đoạn trong n-hexane kết hơ ̣p với sắc ký silica gel sử dụng h ệ dung môi rửa cột n-hexane: acetone theo tỉ lê ̣ 3:1, chất -mangostin đã được tinh sạch vớ i đô ̣ sa ̣ch đa ̣t > 83% tương đương với chất chuẩn , hiệu suất thu hồi đạt 0,06% chỉ sau một lần sắc ký duy nhất . Hiệu suất này cao hơn nhiều so v ới qui trình tinh sạch bằng sắc ký lớp mỏng và bằng quy trình sử dụng 2 cô ̣t sắc ký silicagelmà các tác gi ả trước đây đã công bố [10],[11].
3.2. Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S. mutans trên biofilm biofilm
3.2.1. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm
3.2.1.1. Ức chế sự giảm pH của môi trường
Vi khuẩn S. mutans được xem là tác nhân chính gây ra sâu răng do khả
năng sinh acid cao (chủ yếu là acid lactic), đặc biệt là trong môi trường dư thừa glucose. Chính sự acid hóa mảng bảm răng (thậm chí đến pH dưới 4,0) đã dẫn đến làm mòn men răng và gây sâu răng. Vì vậy, hoạt tính ức chế sự sinh acid của vi khuẩn được xem là một trong những thí nghiệm khởi đầu để khảo sát tác dụng bảo vệ răng của hợp chất cần quan tâm.
Trong thí nghiệm này, biofilm được đưa vào môi trường dư thừa glucose, vì thế quá trình glycolysis sinh acid bị dừng lại bởi pH thấp chứ không phải do thiếu cơ chất đường phân glucose. Hoạt tính ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans được đánh giá thông qua viê ̣c xác đi ̣nh khả năng ức chế sự giảm pH của môi trường của các tế bào S. mutans đã xử lý với các di ̣ch chiết nghiên cứu . Kết quả nghiên cứu được trình bày ở hình 3.9. Số liê ̣u thu được cho thấy di ̣ch - mangostin ở các nồng độ 100M, 150 M và 200 M đã ức chế rõ rê ̣t sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans. Giá trị pH cuối cùng thu được với dịch chiết ở các
nồng đô ̣ lần lươ ̣t là : 5,05; 5,3 và 5,4 trong khi ở mẫu đối chứng (không xử lý dịch chiết ) là 4,4. Như vâ ̣y, dịch chiết -mangostintinh sạch được tại Việt Nam
cũng có khả năn g ức chế sự sinh a cid của S. mutans trên biofilm . Nồng đô ̣ 150
M đươ ̣c lựa cho ̣n cho các thí nghiê ̣m về sau v ì đây là nồng đô ̣ có tác dụng mạnh và phù hợp hơn cho thí nghiê ̣m vì tính tan kém trong n ước của - mangostin.
Hình 3.9. -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S. mutans trên biofilm() Đối chứng ; () -mangostin100 M; () -mangostin150 M; ()-mangostin200 M
3.2.1.2. -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh và chống chịu acid F-ATPase và PTS
Enzyme ATPase được tìm thấy ở tất cả các sinh vật nhân chuẩn, có vai trò phân giải ATP và bơm proton từ tế bào chất ra bên ngoài nhằm ổn định pH nội sinh (pHi), nhờ vậy duy trì được hoạt động của các enzyme và bào quan trong nguyên sinh chất. Ở nhiều loài vi khuẩn, trong đó có S. mutans, enzyme này
đóng vai trò chìa khoá trong việc đảm bảo sự thích nghi của tế bào với điều kiện acid. Có hai loại ATPase là F-ATPase mang phức hệ protein F1-F0 nằm trên màng tế bào có vai trò tạo hoạt tính enzyme và các ATPase vận chuyển các cation như K+-ATPase và Na+-ATPase. Phần lớn hoạt tính phân giải ATP (ATPase) của S. mutans thuộc về F (H+)-ATPase trên màng. Trong số các vi
4 5 6 7 8 pH
Thời gian (giờ)
khuẩn đường miệng, S. mutans là một trong số rất ít loài có khả năng chống chịu acid cao. Vi khuẩn này vẫn có thể tiến hành quá trình đường phân ở pH thậm chí dưới 3,0. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng F-ATPase đóng vai trò chính giúp vi khuẩn S. mutans thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này [14],[15],[16]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số liệu ở hình 3.10 cho thấy hoạt độ F-ATPase của các tế bào thấm đã bị ức chế mạnh bởi -mangostin. Ở nồng đ ộ 150M,hoạt tính enzyme đã bị ức chế >70%. Có thể kết luận rằng F-ATPase rất nhạy cảm với -mangostin.
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của -mangostin lên hoạt độF-ATPase và PTS của S. mutans trên biofilm
Phospho transferase system (PTS)
Đường là nguồn carbohydrate chủ yếu của các vi khuẩn Streptococcus. Tế bào vi khuẩn này có thể đồng hoá được nhiều loại đường khác nhau như glucose, fructose, sucrose...Trước khi đi vào còn đường glycolysis, đường được hoạt hoá thành dạng glucose-6-phosphate nhờ hệ thống enzyme chuyển gốc phosphate (sugar-phosphotransferase system) viết tắt là PTS và hexokinase, trong đó hệ thống PTS đóng vai trò chính [55]. Thí nghiệm được thực hiện với tế bào thấm. Ở tế bào thấm, màng tế bào bị chọc thủng do xử lý với toluene nên tạo điều kiện
0 20 40 60 80 100 % Ứ c ch ế F-ATPase PTS
để các enzyme có thể tiếp xúc dễ dàng hơn với chất nghiên cứu. Trong thí nghiệm này, hệ thống glucose-PTS của tế bào thấm S. mutansbị ức chế bởi - mangostin . Ở nồng độ 150M, khoảng >50% hoạt tính enzyme bị ức chế (Hình 3.10). Điều đó chứng tỏ phức hệ PTS cũng nhạy cảm với -mangostin. Sự ức chế PTS có lẽ đã đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện hoạt tính kháng khuẩn của -mangostin vì enzyme này ức chế quá trình tiếp nhận đường, khâu đầu tiên quan trọng của quá trình đồng hóa đường và sinh acid tiếp theo.
Viê ̣c ức chế các enzyme nằm trên màng tế bào cũng gợi ý màng tế bào là đích tác dụn g đầu tiên của -mangostin. Rất nhiều hợp chất phenol có thể hoa ̣t đô ̣ng như là các chất hoa ̣t đô ̣ng bề mă ̣t theo kiểu không bị ion hóa (nonionic agent) can thiệp vào liên kết lipi d- protein trên màng tế bào . Nhóm hydroxyl (OH) của các chất này cũng c ó khả năng hình thành liên kết với protein và các phân tử sinh ho ̣c k hác như acid lipoteichoic trên bề mă ̣t màng tế bào . - mangostin có mang nhóm OH trong cấu trú c nên có thể có khả năng tương tác và phá hủy màng. Hơn thế nữa, tính chất không phân c ực cao của chất này gợi ý các tương tác này là có thể xảy ra với các nhóm chất ky ̣ nước trên màng tế bào . Kết quả của tương tác này là những thay đổi bao gồm cả viê ̣c phá hủy cấu trúc màng. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các chất phenol có khả năng
tương tác với màng tế bào [46]. Nghiên cứu về cơ chế kháng khuẩn của thymol , một chất phenol từ thực vâ ̣t, lên hàng loa ̣t đối tươ ̣ng vi khuẩn cũng đã cho thấy chất này hoa ̣t đô ̣ng chủ y ếu theo cơ chế phá hủy màng tế bào mô ̣t cách nhanh chóng thông qua tương tác bề mă ̣t (surfactant-like action) [46]. Các kết quả