Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.4. Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin
Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus được đóng trong các lọ thủy tinh. Mỗi lọ chứa 10 liều vacxin (20ml). Vacxin được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 – 8oC, tránh ánh nắng trực tiếp.
Sử dụng các lọ vacxin được sản xuất ở 3 lô là 74, 75, 76 để tiến hành thử nghiệm đánh giá thời gian bảo quản của vacxin.
3.5.4.1. Kiểm tra đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản
Dung dịch vacxin sẽ được lắc đều trước khi sử dụng. Sau khi lắc, vacxin có màu đỏ cam và đồng nhất.
Để đánh giá đặc tính của vacxin trong thời gian bảo quản, tiến hành theo dõi, đánh giá các đặc tính về màu sắc, độ trong suốt và độ đồng nhất sau mỗi 6 tháng bảo quản vacxin ở nhiệt độ 2 – 8oC.
Quan sát và đánh giá bằng cảm quan, ghi chép kết quả theo dõi sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.
3.5.4.2. Kiểm tra tính vô trùng của vacxin trong thời gian bảo quản
Sau mỗi 6 tháng bảo quản, tiến hành kiểm tra tính vô trùng của vacxin ở 3 lô theo phương pháp được nêu ở mục 3.5.1.
Ghi chép kết quả sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.
3.5.4.3. Kiểm tra tính an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản
- Sau mỗi 6 tháng bảo quản, 4 mẫu vacxin ở mỗi lô được lấy ngẫu nhiên và tiêm cho động vật thí nghiệm gồm 2 chuột lang và 10 chuột nhắt trắng với liều tiêm 1ml/con. Theo dõi các triệu chứng lâm sàng của chuột sau khi tiêm trong vòng 7 ngày và thể trọng của chuột ngay trước và sau khi quá trình thử nghiệm kết thúc. Ghi chép kết quả sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.
- Kyoto Biken Porcine Parvovirus là vacxin vô hoạt, do đó để đánh giá tính
an toàn của vacxin trong thời gian bảo quản, cần tiến hành kiểm tra tính bất hoạt của vacxin. Sau mỗi 6 tháng bảo quản, vacxin ở các lô được lấy mẫu và tiến hành kiểm tra như sau:
a. Dụng cụ, thiết bị, nguyên vật liệu
- Dụng cụ: Pipet thủy tinh (2ml, 10ml), chai thủy tinh (100ml, 250ml), khăn lau tẩm cồn, giấy bạc tiệt trùng, túi thẩm tách, khuấy từ
- Nguyên vật liệu:
Mẫu vacxin đã được xử lý loại bỏ Formalin bằng phương pháp thẩm tách. Chủng virus 90HS-SK.
Tế bào SK-H nồng độ 20x104 tế bào/ml, nuôi kín 1 lớp trên chai flask 25cm2.
Eg-MEM 10x, PBS 10x, FBS, NaHCO3 7%, kháng sinh, kháng nấm (Fungizone), hồng cầu gà 0.5%, BPW.
b. Quy trình
- Pha chế môi trường MEM 1x theo công thức sau:
STT Thành phần Số lượng (pha cho 1000ml)
1 BPW Vừa đủ 1000ml
2 Eg-MEM 10x 100ml
3 Kháng sinh 5ml
4 Fungizone 1,6ml
- PBS 1x được pha chế theo công thức sau:
STT Thành phần Số lượng (pha cho 100ml)
1 BPW Vừa đủ 100ml
2 PBS 10x 10ml
- Pha môi trường duy trì tế bào sau gây nhiễm (VGM):
STT Thành phần Số lượng (pha cho 100ml)
1 MEM 1x Vừa đủ 100ml
2 3%FBS 3ml
3 1,5% NaHCO3 7% 1,5ml
Pha đủ số lượng môi trường cần dùng cho một lần thử nghiệm. * Quy trình thử nghiệm
Mỗi mẫu vacxin sử dụng 5 chai tế bào SK-H để thử nghiệm. - Loại bỏ dịch nuôi cấy ở các chai tế bào.
- Gây nhiễm 3 chai tế bào bằng mẫu vacxin, mỗi chai gây nhiễm 1ml. - 1 chai đối chứng âm: không gây nhiễm mẫu vacxin, bổ sung 1ml PBS1x. - 1 chai đối chứng dương: gây nhiễm 1ml chủng 90HS-SK.
- Loại bỏ dịch ở 3 chai mẫu và chai đối chứng sau hấp phụ.
- Rửa tế bào bằng 10ml PBS1x/chai, láng nhẹ bề mặt tế bào, sau đó loại bỏ dịch rửa và thêm 10ml môi trường duy trì (VGM)/chai.
Chú ý: Thực hiện thao tác ở các chai theo thứ tự : chai đối chứng âm, chai mẫu, chai đối chứng dương.
- Nuôi cấy các chai tế bào ở 37oC, nuôi tĩnh. - Đánh giá kết quả sau 10 ngày nuôi cấy. c. Đánh giá
Sau 10 ngày nuôi cấy, quan sát tế bào dưới kính hiển vi soi ngược và tiến hành lấy mẫu xác định tính ngưng kết hồng cầu gà. Thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu gà như sau:
- Hút dịch nổi 1ml từ các chai đối chứng, chai mẫu vào mỗi ống nghiệm (10 ống nghiệm/mẫu thử nghiệm);
- Nhỏ 400µl hồng cầu gà 0.5% vào mỗi ống nghiệm;
- Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút rồi đọc kết quả. Kết quả được đánh giá như sau:
- Chai đối chứng âm: Các ống nghiệm không xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu;
- Chai đối chứng dương: Các ống nghiệm xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu.
- Các chai mẫu:
Nếu hồng cầu không ngưng kết giống như chai đối chứng âm: Kết luận không có virus sống tồn tại trong mẫu vacxin.
Nếu hồng cầu ngưng kết giống như chai đối chứng dương: Kết luận có virus sống tồn tại trong mẫu vacxin.
- Nếu chai đối chứng bất thường thì kết quả thử nghiệm không được chấp nhận, cần thực hiện lại thử nghiệm.
Ghi chép kết quả sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.
3.5.4.4. Kiểm tra hiệu lực của vacxin trong thời gian bảo quản
Sau mỗi 6 tháng bảo quản, tiến hành tiêm vacxin ở các lô cho chuột lang với liều 0.5ml/con, tiêm 2 mũi cách nhau 4 tuần. Lấy máu chuột sau 21 ngày
tiêm vacxin, chắt huyết thanh và tiến hành thử nghiệm HI để xác định hàm lượng kháng thể trong máu của chuột.
Thử nghiệm HI với huyết thanh chuột lang được tiến hành tương tự như thử nghiệm HI đối với huyết thanh lợn.
Ghi chép kết quả sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.
3.5.4.5. Kiểm tra độ ổn định pH của vacxin trong thời gian bảo quản
Sau mỗi 12 tháng, vacxin ở các lô được lấy mẫu để kiểm tra độ ổn định pH trong thời gian bảo quản. pH của vacxin được đo bằng máy đo pH (pH meter). Tất cả các phép đo đều được tiến hành trong cùng một điều kiện nhiệt độ khoảng từ 20-25oC. Ghi chép kết quả sau mỗi lần kiểm tra, đánh giá.