Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin
Kiểm tra hiệu lực của vacxin là một yêu cầu cần thiết để đảm bảo vacxin sau khi sử dụng đem lại hiệu quả bảo hộ cho con vật với tác nhân gây bệnh đặc hiệu. Có nhiều phương pháp kiểm tra hiệu lực như công cường độc, định lượng kháng nguyên, định lượng kháng thể trong huyết thanh, thử hiệu lực lâm sàng.
PPV là virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, để kiểm tra hiệu lực của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus, sử dụng phương pháp định lượng kháng
thể trong huyết thanh của con vật tại thời điểm có miễn dịch chắc chắn sau khi tiêm vacxin bằng phản ứng HI. Thông qua hiệu giá của phản ứng HI để đánh giá hiệu lực của vacxin.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 31VR-10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1.
3.5.3.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng 6 lợn cái là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu của lợn bằng phản ứng HI. Lợn đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm phải có hiệu giá kháng thể < 10 (âm tính với kháng thể chống Porcine Parvovirus).
Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;
- Lô miễn dịch (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 01 liều vacxin ghi trên nhãn.
STT Lô thí
nghiệm Số con
Liều và đường đưa
vacxin Phương pháp đánh giá
1 Lô
đối chứng 03 Không dùng vacxin
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
2 Lô
miễn dịch 03
Tiêm 2ml/con, tiêm dưới da
Tiêm 2 mũi cách nhau 04 tuần
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
- Hai lô thí nghiệm được theo dõi triệu chứng lâm sàng liên tục 49 ngày sau khi tiêm vacxin.
- Lấy máu toàn bộ lợn ở lô miễn dịch và đối chứng tại thời điểm 28 ngày sau khi tiêm vacxin mũi 1 và 21 ngày sau khi tiêm mũi 2, chắt lấy huyết thanh và kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng HI.
3.5.3.2. Phản ứng HI a. Dụng cụ, thiết bị
Ống nghiệm nhỏ, pipet man, pipet đa kênh, pipet thủy tinh, đầu tip, chai thủy tinh, phiến 96 giếng, ống ly tâm 50mL, mixer, máy ly tâm, cân phân tích, cối, khăn lau tẩm cồn.
b. Nguyên vật liệu
- PBS 1x, chất chống đông Alserve, bột Kaolin; - Kháng nguyên Porcine Parvovirus.
c, Phương pháp tiến hành * Pha dung dịch Kaolin 25%
- Cân 25g bột Kaolin. Đổ toàn bộ bột Kaolin ra cối;
- Dùng pipet thủy tinh hút 20mL PBS1x nhả vào bột Kaolin trong cối; - Chà Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất; - Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin trong cối vào ống Falcol; - Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm; - Hòa cặn Kaolin với 10mL PBS1x, mix đều để tạo hỗn dịch;
- Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào cối (đã rửa sạch); - Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào cối;
- Chà hỗn dịch Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất - Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào ống Falcol;
- Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm, giữ lại cặn Kaolin; - Cho khoảng 50mL PBS1x vào chai thủy tinh;
- Hút 10 mL PBS1x vào ống Falcol chứa cặn Kaolin, mix đều để tạo hỗn dịch; - Hút toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào chai thủy tinh chứa PBS1x;
- Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào chai thủy tinh; - Bổ sung PBS1x vừa đủ 100mL được dung dịch Kaolin 25%.
* Rửa và pha hồng cầu gà 0.5%
- Ly tâm máu gà đựng trong ống Falcol có chứa Alserver với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Thêm PBS1x vừa đủ 40mL vào ống Falcol, lắc nhẹ và đều rồi đem ly tâm với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Thêm PBS1x vừa đủ 40mL và tiến hành lặp lại các thao tác ly tâm, hút, rửa cho đến khi dịch nổi sau ly tâm là dịch trong (khoảng 3 – 4 lần);
- Ở lần cuối cùng hút dịch nổi sau ly tâm, hút bỏ hoàn toàn PBS1x, phần còn lại là hồng cầu đặc 100%;
-Pha hồng cầu 0.5% bằng PBS1X từ hồng cầu đặc 100% với lượng vừa đủ cho thử nghiệm.
* Xử lý huyết thanh lợn
- Cho 0.4ml PBS vào ống nghiệm;
- Thêm 0.1ml huyết thanh mẫu vào ống nghiệm;
- Thêm 0.5ml dung dịch Kaolin 25% vào ống nghiệm và nút ống nghiệm lại; Như vậy, huyết thanh đã được pha loãng 1/10.
- Trộn đều bằng mixer. Ủ ở nhiệt độ phòng trên 20 phút. Trong thời gian đó, cứ 5 phút mix lại 1 lần;
- Ly tâm trong 20 phút với tốc độ 2500 vòng/phút;
- Thu dịch nổi cho vào 1 ống nghiệm khác. Sau đó thêm 0.03ml hồng cầu gà lắc nhẹ rồi ủ ở nhiệt độ phòng trên 15 phút. Trong thời gian đó, cứ 5 phút lắc lại 1 lần;
- Tiến hành ly tâm trong 10 phút với tốc độ 2500 vòng/phút. Thu lấy dịch nổi (huyết thanh pha loãng 10 lần) cho sang ống nghiệm khác. Không cần phải bất hoạt.
* Kiểm định kháng nguyên lần thứ 1
- Ghi các độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng; - Dùng pipet chia 50µL PBS vào các giếng từ 1 đến 10;
- Cho 50µL kháng nguyên vào giếng 1. Dùng pipet hút lên hút xuống vài lần. Sau đó hút 50µL từ giếng 1 sang giếng 2;
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng 512). Cuối cùng, hút bỏ 50µL kháng nguyên đã pha loãng ở giếng 9;
- Bổ sung 50µL PBS vào tất cả các giếng; - Bổ sung 50µL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá;
- Sau khi đánh giá, xác định được giá trị HA và độ pha loãng kháng nguyên dùng cho thử nghiệm HI.
* Thử nghiệm HI
- Ghi số huyết thanh tương ứng với số lợn được đánh dấu, độ pha loãng và đối chứng huyết thanh (SC) lên phiến 96 giếng;
- Dùng pipet đa kênh chia 50µL PBS vào tất cả các giếng trừ giếng 1; - Dùng pipet man chia 50µL huyết thanh đã xử lý (huyết thanh đã được pha loãng 10 lần) vào giếng 1 và giếng 2;
- Dùng pipet hút lên hút xuống vài lần ở giếng 2.Sau đó hút 50µL từ giếng 2 sang giếng 3;
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng). Cuối cùng, hút bỏ 50µL huyết thanh đã pha loãng ở giếng 9;
- Bổ sung 50µL kháng nguyên (là kháng nguyên đã được pha loãng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào các giếng từ 1 đến 9, lắc đều;
- Hấp phụ kháng nguyên ở tủ lạnh từ 2 – 8oC trong 18 giờ;
- Bổ sung hồng cầu gà 0.5% vào toàn bộ các giếng, sau đó lắc đều; - Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá. * Kiểm định kháng nguyên lần 2 (8HA đơn vị kháng nguyên) - Ghi độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng; - Dùng pipet chia 50µL PBS vào các giếng từ 2 đến 8;
- Cho 50µL kháng nguyên (là kháng nguyên đã được pha loãng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào giếng 1 và giếng 2;
- Pha loãng kháng nguyên bậc 2 từ giếng 2 đến giếng 7 (hằng số pha loãng 64).
Cuối cùng, hút bỏ 50µL kháng nguyên đã pha loãng ở giếng 7. - Bổ sung 50µL PBS vào toàn bộ các giếng;
- Bổ sung 50µL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá. d, Đánh giá kết quả của phản ứng HI
- Hiệu giá kháng thể trong phản ứng HI là nồng độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh mà ở đó không xảy ra hiện tượng ngưng kết hồng cầu;
- Nếu hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn lấy tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm mũi 2 ≥ 80 thì vacxin đạt hiệu quả bảo hộ;
- Nếu hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của lợn lấy tại thời điểm 21 ngày sau khi tiêm mũi 2 < 80 thì vacxin không đạt hiệu quả bảo hộ.