3.5.1. Kiểm tra tính vô trùng của vacxin
Vacxin khi đưa vào sử dụng cho động vật cần đạt yêu cầu về tính vô trùng, vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh. Thử nghiệm vô trùng có thể thực hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp. Phương pháp màng lọc dùng một bơm chân không hút tất cả vacxin trong lọ cần kiểm tra đi qua một màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn hoặc bằng 0.45µm để giữ lại vi khuẩn và nấm trên màng, rửa màng lọc để loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách cho các dung dịch rửa đi qua, sau đó nuôi cấy màng lọc trong các môi trường thích hợp cho vi khuẩn và nấm phát triển. Trong nghiên cứu này, phương pháp cấy trực tiếp được sử dụng để
kiểm tra tính vô trùng của vacxin. Sử dụng 2 loại môi trường là Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD) để kiểm tra.
-Môi trường TGC được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí. -Môi trường SCD được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp thử vô trùng của vacxin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y quy định trong TCVN 8684:2011.
3.5.1.1. Dụng cụ, thiết bị, nguyên vật liệu a. Dụng cụ, thiết bị
- Thìa cân, cốc cân/ giấy cân; - Ống đong;
- Chai thủy tinh có chia vạch;
- Ống nghiệm có đường kính 23x150mm; - Nút silicon xốp;
- Pipet thủy tinh vô khuẩn 10ml; - Giá đựng ống nghiệm;
- Khăn lau tẩm cồn; - Pipet aid;
- Cân phân tích;
- Máy khuấy từ gia nhiệt; - Lò hấp tiệt trùng. b. Nguyên vật liệu
- Nước tinh khiết Bulk Purified Water; - Bột Thioglycolat (TGC) (Hãng Merck);
- Bột Soybean Casein Digest (SCD) (Hãng Merck). 3.5.1.2. Tiến hành
a. Pha môi trường thử vô trùng - Tính lượng môi trường cần pha;
- Cân bột TGC và SCD theo tỷ lệ: 30g/1000ml; - Chuẩn bị chai đựng, dán nhãn, ghi ngày pha; - Cho 1/2 - 1/3 lượng nước vào từng chai.
TGC: sử dụng nước nóng khoảng 70oC. SCD: sử dụng nước ở nhiệt độ thường.
- Thêm lượng bột TGC và SCD đã cân vào từng chai đó.
- Thêm nốt lượng nước còn lại cho vừa đủ thể tích cần pha (nghiêng chai rót nước từ miệng chai xuống sao cho hòa tan nốt lượng bột còn dính trên thành chai).
- Cho nam châm vào, sử dụng máy khuấy từ thực hiện khuấy cho tan hoàn toàn.
- Dùng pipet hút 15ml TGC, SCD môi trường cho vào ống nghiệm, xếp ống nghiệm lên giá. Đạy nút silicon xốp sâu tới 2/3 nút.
Ghi nhãn đầy đủ các thông tin: Tên môi trường, ngày pha, hạn sử dụng - Hấp tiệt trùng môi trường đã chia trong các ống nghiệm ở 121oC trong 15 phút.
- Sau khi kết thúc quá trình tiệt trùng, để nguội môi trường ở nhiệt độ phòng. Môi trường đã pha có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 - 25 oC) và sử dụng trong 3 tuần.
b. Quy trình thử vô trùng
Thử nghiệm vô trùng phải thực hiện dưới điều kiện hốt Biosafety Cabinet class II đạt cấp độ A, trong nền phòng sạch cấp độ B. Phòng sạch phải được kiểm soát áp xuất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và giám sát vi sinh. Người thực hiện được trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng và tuân thủ mọi quy trình ra vào khu vực sạch.
- Lấy mẫu vacxin ra khỏi nơi bảo quản, lau cồn ngoài vỏ lọ vacxin trước khi chuyển vào Clean Bench.
- Thể tích mẫu vacxin được lấy để cấy:
Môi trường TGC: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử; 0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử. Môi trường SCD: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử; 0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử.
- Lắc đều mẫu vacxin, mở nắp lọ và dùng pipet thủy tinh hút mẫu vacxin vào ống môi trường. Lắc đều.
- Sử dụng 2 ống thử của mỗi loại môi trường TGC và SCD, cấy 1ml nước cất/ ống để làm đối chứng.
- Các ống môi trường TGC sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ 36 – 38oC, các ống môi trường SCD được nuôi ở nhiệt độ 20 – 25oC trong 14 ngày.
c. Đánh giá
Sau khi nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả ở các thời điểm 3 – 5 ngày, 7 – 9 ngày, 14 ngày sau khi cấy bằng các so sánh màu và độ đục của ống đã cấy mẫu vacxin và ống đối chứng cùng loại.
- Kết quả dương tính khi môi trường tạo váng, đục hoặc lắng cặn;
- Kết quả âm tính khi môi trường không có sự thay đổi về màu sắc và độ đục, giống ống đối chứng.
Vacxin được coi là vô trùng khi tất cả các ống thử đều âm tính sau 14 ngày nuôi cấy.
Trong trường hợp ống thử dương tính, làm tiêu bản nhuộm Gram, soi kính hiển vi để phát hiện loại vi sinh vật tiến hành nhắc lại thử nghiệm.
Nếu không bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai thì sản phẩm được coi là vô trùng. Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai với cùng loại vi sinh vật ở lần kiểm tra thứ nhất thì sản phẩm không đạt tính vô trùng. Nếu bị nhiễm ở lần kiểm tra thứ hai không cùng loại vi sinh vật ở lần kiểm tra thứ nhất thì tiến hành thử nghiệm lần ba.
Nếu ở lần kiểm tra thứ ba kết quả không bị nhiễm thì sản phẩm được coi là vô trùng. Nếu ở lần kiểm tra thứ ba kết quả bị nhiễm dù chỉ một ống, cho dù là bất kỳ loại vi sinh vật nào thì sản phẩm được coi là không đảm bảo tính vô trùng.
3.5.2. Kiểm tra tính an toàn của vacxin
An toàn là một chỉ tiêu quan trọng của một vacxin. Kyoto Biken Porcine
Parvovirus là vacxin vô hoạt, độ an toàn được đánh giá qua thử nghiệm sử dụng
quá liều gấp 2 lần so với chỉ định.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 31VR- 10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1.
3.5.2.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng 6 lợn cái là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày, khỏe mạnh.
Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;
- Lô thí nghiệm (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 02 liều vacxin ghi trên nhãn.
STT Lô Số con Liều và đường đưa vacxin Phương pháp đánh giá
1 Đối chứng 03 Không dùng vacxin - Theo dõi triệu chứng lâm sàng
2 Thí nghiệm 03 Tiêm 4ml/con, tiêm dưới da - Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lợn được theo dõi các triệu chứng lâm sàng toàn thân và các phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm trong vòng 21 ngày sau khi tiêm vacxin.
Phản ứng toàn thân bao gồm: Sốc phản vệ, sốt, kém ăn, bỏ ăn, thở khó bất thường, chảy nước bọt, …
Phản ứng cục bộ tại vị trí tiêm: Sưng, áp xe, viêm.
Nếu có lợn chết sẽ tiến hành mổ khám và kiểm tra bệnh tích.
Ghi chép chi tiết số lợn ốm, chết. Mô tả chi tiết triệu chứng lâm sàng và bệnh tích nếu động vật chết.
- Thể trọng: Thể trọng của từng lợn trong thí nghiệm được cân ngay trước khi tiêm vacxin và ngay sau khi quá trình thí nghiệm kết thúc.
3.5.2.2. Đánh giá
- Sau khi tiêm vacxin, nếu lợn sống khỏe mạnh, sinh trưởng và phát triển bình thường, không có các phản ứng bất thường trong thời gian 21 ngày sau khi tiêm vacxin thì vacxin đảm bảo tính an toàn.
- Nếu lợn xuất hiện các triệu chứng bất thường liên quan đến vacxin thì vacxin không đảm bảo tính an toàn.
3.5.3. Kiểm tra hiệu lực của vacxin
Kiểm tra hiệu lực của vacxin là một yêu cầu cần thiết để đảm bảo vacxin sau khi sử dụng đem lại hiệu quả bảo hộ cho con vật với tác nhân gây bệnh đặc hiệu. Có nhiều phương pháp kiểm tra hiệu lực như công cường độc, định lượng kháng nguyên, định lượng kháng thể trong huyết thanh, thử hiệu lực lâm sàng.
PPV là virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, để kiểm tra hiệu lực của vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus, sử dụng phương pháp định lượng kháng
thể trong huyết thanh của con vật tại thời điểm có miễn dịch chắc chắn sau khi tiêm vacxin bằng phản ứng HI. Thông qua hiệu giá của phản ứng HI để đánh giá hiệu lực của vacxin.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp được quy định trong 31VR-10/KN1 tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1.
3.5.3.1. Bố trí thí nghiệm
Sử dụng 6 lợn cái là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire) ở độ tuổi 150 ngày. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong máu của lợn bằng phản ứng HI. Lợn đủ tiêu chuẩn sử dụng cho thí nghiệm phải có hiệu giá kháng thể < 10 (âm tính với kháng thể chống Porcine Parvovirus).
Thí nghiệm được bố trí như sau:
- Lô đối chứng (03 con): không tiêm vacxin;
- Lô miễn dịch (03 con): mỗi lợn được tiêm dưới da với 01 liều vacxin ghi trên nhãn.
STT Lô thí
nghiệm Số con
Liều và đường đưa
vacxin Phương pháp đánh giá
1 Lô
đối chứng 03 Không dùng vacxin
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
2 Lô
miễn dịch 03
Tiêm 2ml/con, tiêm dưới da
Tiêm 2 mũi cách nhau 04 tuần
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng
- Lấy máu kiểm tra kháng thể
- Hai lô thí nghiệm được theo dõi triệu chứng lâm sàng liên tục 49 ngày sau khi tiêm vacxin.
- Lấy máu toàn bộ lợn ở lô miễn dịch và đối chứng tại thời điểm 28 ngày sau khi tiêm vacxin mũi 1 và 21 ngày sau khi tiêm mũi 2, chắt lấy huyết thanh và kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng HI.
3.5.3.2. Phản ứng HI a. Dụng cụ, thiết bị
Ống nghiệm nhỏ, pipet man, pipet đa kênh, pipet thủy tinh, đầu tip, chai thủy tinh, phiến 96 giếng, ống ly tâm 50mL, mixer, máy ly tâm, cân phân tích, cối, khăn lau tẩm cồn.
b. Nguyên vật liệu
- PBS 1x, chất chống đông Alserve, bột Kaolin; - Kháng nguyên Porcine Parvovirus.
c, Phương pháp tiến hành * Pha dung dịch Kaolin 25%
- Cân 25g bột Kaolin. Đổ toàn bộ bột Kaolin ra cối;
- Dùng pipet thủy tinh hút 20mL PBS1x nhả vào bột Kaolin trong cối; - Chà Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất; - Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin trong cối vào ống Falcol; - Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm; - Hòa cặn Kaolin với 10mL PBS1x, mix đều để tạo hỗn dịch;
- Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào cối (đã rửa sạch); - Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào cối;
- Chà hỗn dịch Kaolin trong cối cho đến khi tạo thành hỗn dịch mịn, đồng nhất - Dùng pipet 10mL hút hết toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào ống Falcol;
- Tiến hành ly tâm với tốc độ 3000 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm, giữ lại cặn Kaolin; - Cho khoảng 50mL PBS1x vào chai thủy tinh;
- Hút 10 mL PBS1x vào ống Falcol chứa cặn Kaolin, mix đều để tạo hỗn dịch; - Hút toàn bộ hỗn dịch Kaolin vào chai thủy tinh chứa PBS1x;
- Tráng lại ống Falcol bằng 10mL PBS1x rồi đổ vào chai thủy tinh; - Bổ sung PBS1x vừa đủ 100mL được dung dịch Kaolin 25%.
* Rửa và pha hồng cầu gà 0.5%
- Ly tâm máu gà đựng trong ống Falcol có chứa Alserver với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Thêm PBS1x vừa đủ 40mL vào ống Falcol, lắc nhẹ và đều rồi đem ly tâm với tốc độ 2500 vòng/ 5 phút;
- Dùng bơm hút chân không hút bỏ phần dịch nổi sau ly tâm;
- Thêm PBS1x vừa đủ 40mL và tiến hành lặp lại các thao tác ly tâm, hút, rửa cho đến khi dịch nổi sau ly tâm là dịch trong (khoảng 3 – 4 lần);
- Ở lần cuối cùng hút dịch nổi sau ly tâm, hút bỏ hoàn toàn PBS1x, phần còn lại là hồng cầu đặc 100%;
-Pha hồng cầu 0.5% bằng PBS1X từ hồng cầu đặc 100% với lượng vừa đủ cho thử nghiệm.
* Xử lý huyết thanh lợn
- Cho 0.4ml PBS vào ống nghiệm;
- Thêm 0.1ml huyết thanh mẫu vào ống nghiệm;
- Thêm 0.5ml dung dịch Kaolin 25% vào ống nghiệm và nút ống nghiệm lại; Như vậy, huyết thanh đã được pha loãng 1/10.
- Trộn đều bằng mixer. Ủ ở nhiệt độ phòng trên 20 phút. Trong thời gian đó, cứ 5 phút mix lại 1 lần;
- Ly tâm trong 20 phút với tốc độ 2500 vòng/phút;
- Thu dịch nổi cho vào 1 ống nghiệm khác. Sau đó thêm 0.03ml hồng cầu gà lắc nhẹ rồi ủ ở nhiệt độ phòng trên 15 phút. Trong thời gian đó, cứ 5 phút lắc lại 1 lần;
- Tiến hành ly tâm trong 10 phút với tốc độ 2500 vòng/phút. Thu lấy dịch nổi (huyết thanh pha loãng 10 lần) cho sang ống nghiệm khác. Không cần phải bất hoạt.
* Kiểm định kháng nguyên lần thứ 1
- Ghi các độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng; - Dùng pipet chia 50µL PBS vào các giếng từ 1 đến 10;
- Cho 50µL kháng nguyên vào giếng 1. Dùng pipet hút lên hút xuống vài lần. Sau đó hút 50µL từ giếng 1 sang giếng 2;
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng 512). Cuối cùng, hút bỏ 50µL kháng nguyên đã pha loãng ở giếng 9;
- Bổ sung 50µL PBS vào tất cả các giếng; - Bổ sung 50µL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá;
- Sau khi đánh giá, xác định được giá trị HA và độ pha loãng kháng nguyên dùng cho thử nghiệm HI.
* Thử nghiệm HI
- Ghi số huyết thanh tương ứng với số lợn được đánh dấu, độ pha loãng và đối chứng huyết thanh (SC) lên phiến 96 giếng;
- Dùng pipet đa kênh chia 50µL PBS vào tất cả các giếng trừ giếng 1; - Dùng pipet man chia 50µL huyết thanh đã xử lý (huyết thanh đã được pha loãng 10 lần) vào giếng 1 và giếng 2;
- Dùng pipet hút lên hút xuống vài lần ở giếng 2.Sau đó hút 50µL từ giếng 2 sang giếng 3;
- Tiếp tục pha loãng bậc 2 cho đến hết giếng 9 (hằng số pha loãng). Cuối cùng, hút bỏ 50µL huyết thanh đã pha loãng ở giếng 9;
- Bổ sung 50µL kháng nguyên (là kháng nguyên đã được pha loãng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào các giếng từ 1 đến 9, lắc đều;
- Hấp phụ kháng nguyên ở tủ lạnh từ 2 – 8oC trong 18 giờ;
- Bổ sung hồng cầu gà 0.5% vào toàn bộ các giếng, sau đó lắc đều; - Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá. * Kiểm định kháng nguyên lần 2 (8HA đơn vị kháng nguyên) - Ghi độ pha loãng và PBS (đối chứng) lên phiến 96 giếng; - Dùng pipet chia 50µL PBS vào các giếng từ 2 đến 8;
- Cho 50µL kháng nguyên (là kháng nguyên đã được pha loãng bằng PBS sau kết quả kiểm định kháng nguyên lần 1) vào giếng 1 và giếng 2;
- Pha loãng kháng nguyên bậc 2 từ giếng 2 đến giếng 7 (hằng số pha loãng 64).
Cuối cùng, hút bỏ 50µL kháng nguyên đã pha loãng ở giếng 7. - Bổ sung 50µL PBS vào toàn bộ các giếng;
- Bổ sung 50µL hồng cầu gà 0.5%, lắc đều;
- Giữ ổn định ở nhiệt độ phòng. Sau 60 phút, tiến hành đánh giá.