2.3.1. Khái niệm về vacxin
Theo quan điểm trước đây, vacxin là một chế phẩm sinh học trong đó chứa chính mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra một bệnh truyền nhiễm nào đó cần phòng (nếu là mầm bệnh thì phải được giết chết hoặc làm nhược độc bởi các yếu tố vật lý, hóa học và sinh vật học). Khi sử dụng cho động vật, vacxin tạo ra một đáp ứng miễn dịch chủ động giúp động vật chống lại được sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng). Ngày nay, vacxin không chỉ còn là chế phẩm từ vi sinh vật hoặc ký sinh trùng được dùng để phòng bệnh mà còn được làm từ các vật liệu sinh học khác (không vi sinh vật) và được dùng với mục đích không phòng bệnh. Nhưng dù là vacxin được chế tạo từ vật liệu nào và được dùng với mục đích gì thì thành phần bắt buộc phải có trong vacxin là kháng nguyên và khi đưa vào cơ thể động vật, kháng nguyên sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch. Như vậy, hiện nay vacxin được hiểu với khái niệm rộng hơn: Vacxin là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có thể tạo cho cơ thể một đáp ứng miễn dịch và được dùng với mục địch phòng bệnh hoặc mục đích khác (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
Vacxin tạo ra trong cơ thể sống một đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể sử dụng vacxin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo và có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng.
2.3.2. Đặc tính cơ bản của vacxin
Vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính cơ bản là: Tính sinh miễn dịch (tính mẫn cảm), tính kháng nguyên (tính sinh kháng thể), tính hiệu lực và tính an toàn (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm: Là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể hoặc tế bào hoặc cả hai.
Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể: Một vacxin khi đưa vào cơ thể phải có khả năng kích thích cơ thể sinh ra kháng thể.
Tính hiệu lực: Tính hiệu lực nói lên khả năng bảo hộ động vật sau khi được sử dụng vacxin.
Tính an toàn: Là một đặc tính quan trọng. Vacxin sau khi sản xuất phải được kiểm định chặt chẽ về mặt vô trùng, thuần khiết, vô độc.
2.3.3. Phân loại vacxin
Có thể chia vacxin làm 4 loại: Vacxin chết (Vô hoạt); Vacxin sống; Vacxin dưới đơn vị; Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
2.3.3.1. Vacxin chết
Là loại vacxin được chế từ các yếu tố gây bệnh (virus hoặc vi khuẩn) đã được làm chết bằng các phương pháp hóa học hoặc vật lý nhưng vẫn giữ được tính mẫn cảm và tính kháng nguyên.
Vacxin chết có ưu điểm: Không độc, không gây ô nhiễm môi trường, tính an toàn cao, dễ bảo quản.
Nhược điểm của loại vacxin này là: Thời gian duy trì miễn dịch ngắn do lượng kháng nguyên cố định và ít dần chứ không nhân lên được như vacxin sống; Liều lượng tiêm lớn, do đó khó tiêm và dễ gây áp xe; Miễn dịch xuất hiện chậm, gây miễn dịch tế bào kém; Không dùng để can thiệp trực tiếp vào ổ dịch; Phải đưa vacxin nhiều lần làm tăng nguy cơ dị ứng.
2.3.3.2. Vacxin sống
Là loại vacxin được sản xuất nhờ chủng vi sinh vật còn sống, hầu như không có tính gây bệnh cho động vật được tiêm phòng nhưng có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mạnh, chúng nhân lên trong cơ thể vật chủ và tiếp tục tạo ra sự kích thích của kháng nguyên trong một khoảng thời gian.
Vacxin nguyên độc: Dùng chủng virus nguyên độc có quan hệ từ các loài động vật khác. Đưa vào cơ thể virus có độc lực hoặc đã làm giảm một phần độc lực theo con đường thực nghiệm (không giống sự xâm nhập của chúng trong tự nhiên).
Vacxin vô độc (Vacxin nhược độc tự nhiên): Được sản xuất từ những chủng vi sinh vật vô độc phân lập trong tự nhiên.
Vacxin nhược độc hóa: Được sản xuất từ những chủng vi sinh vật sống có độc lực yếu, không có khả năng gây bệnh cho động vật được tiêm chủng. Các chủng vi sinh vật này được làm giảm độc lực bằng các phương pháp: vật lý, hóa học, sinh vật học và công nghệ gen.
Vacxin sống có ưu điểm: Tạo miễn dịch nhanh, mạnh, miễn dịch tồn tại lâu bền do vi sinh vật vẫn có khả năng nhân lên và tồn tại lâu trong cơ thể được tiêm chủng; Tạo miễn dịch tế bào cao hơn so với vacxin chết; Có thể dùng can thiệp trực tiếp vào ổ dịch; Liều lượng ít, dễ tiêm chủng.
Nhược điểm của vacxin sống là: Mức độ an toàn thấp do đột biến dẫn đến sự trở lại cường độc; Tạp nhiễm virus trong nuôi cấy tế bào; Không sử dụng được cho động vật mang thai; Không dùng cho những vùng an toàn dịch; Khó bảo quản, chi phí lớn.
2.3.3.3. Vacxin dưới đơn vị
Là loại vacxin chứa những kháng nguyên tương đối tinh khiết phân lập từ virus hay vi khuẩn sinh bệnh.
Vacxin dưới đơn vị có mức độ thuần nhất và tinh khiết hơn toàn bộ vi sinh vật cho nên các tính mẫn cảm, tính sinh kháng thể và tính hiệu lực đều cao. 2.3.3.4. Vacxin thế hệ mới sản xuất bằng công nghệ gen
Vacxin thế hệ mới là thành phẩm của một quy trình có sự can thiệp, sử dụng, thao tác của công nghệ gen.
Trong một loại vacxin, yếu tố quyết định tính sinh miễn dịch chính là thành phần protein đặc biệt có trên bề mặt của vi sinh vật gây bệnh. Thành phần protein này được gọi là kháng nguyên và do một gen hay một số gen có trong hệ gen của vi sinh vật gây bệnh quyết định tổng hợp nên. Những gen chịu trách nhiệm về việc tổng hợp (hay sản xuất) protein kháng nguyên được gọi là gen kháng nguyên. Nếu tách gen kháng nguyên khỏi vật liệu di truyền của vi sinh vật rồi ghép vào một hệ thống plasmid vector thích ứng nào đó thì gen kháng nguyên
này vẫn hoạt động như khi tồn tại trong hệ gen của vi sinh vật chủ và phân tử protein kháng nguyên được tổng hợp ra vẫn có thể có chức năng như cũ, tức là có tính sinh miễn dịch. Chế phẩm protein kháng nguyên được tạo ra như thế được gọi là vacxin tái tổ hợp gen hay vacxin thế hệ mới – vacxin công nghệ gen.
2.3.4. Nguyên lý sử dụng vacxin
Khi đưa vacxin vào cơ thể động vật, với sự kích thích của yếu tố kháng nguyên có trong vacxin, hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, tạo ra một đáo ứng miễn dịch dịch thể và tế bào. Đáp ứng này làm sản sinh ra các yếu tố vận chuyển để chống lại kháng nguyên, đó là kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào. Các yếu tố này lưu thông trong máu và dịch thể của cơ thể động vật, gây ra trạng thái miễn dịch tiếp thu chủ động nhân tạo. Khi kháng nguyên là mầm bệnh cường độc từ bên ngoài xâm nhập, chúng sẽ bị các kháng thể đặc hiệu tiêu diệt hoặc loại trừ, không thực hiện được quá trình gây bệnh. Phản ứng tiêu diệt hoặc loại trừ mầm bệnh của các yếu tố kháng thể rất đặc hiệu. Vì vậy, không phải vacxin nào cũng gây miễn dịch chung chống lại mọi tác nhân gây bệnh, vacxin tạo ra từ loại tác nhân gây bệnh nào thì chỉ có tác dụng sinh đáp ứng miễn dịch chống lại chính tác nhân đó (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
2.3.5. Quy luật hình thành kháng thể sau khi sử dụng vacxin ở động vật
Khi đưa vacxin vào cơ thể, kháng thể chưa sinh ra ngay lập tức mà phải sau một thời gian tiềm tàng, dài hay ngắn phụ thuộc vào kháng nguyên chứa trong vacxin và sự xâm nhập của kháng nguyên vacxin lần đầu hay lần thứ hai, thứ ba, … Sau đó kháng thể mới được sinh ra, lượng kháng thể tăng dần, đạt mức cao nhất sau 2 – 3 tuần rồi giảm dần và mất đi sau vài tháng hoặc vài năm. Sử dụng vacxin lần đầu, đáp ứng miễn dịch gọi là sơ cấp hay tiên phát. Sử dụng vacxin lần hai, đáp ứng miễn dịch gọi là thứ cấp hay thứ phát. Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát, thời gian tiềm tàng ngắn hơn, lượng kháng thể sinh ra nhiều hơn và thời gian xuất hiện kháng thể sớm (Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương, 2010).
2.3.6. Vacxin phòng bệnh gây ra do PPV
Hiện nay, trên thị trường vacxin của nước ta đang lưu hành khá nhiều loại vacxin phòng bệnh gây ra do PPV. Nhưng chỉ có một loại được sản xuất trong nước, đó là vacxin “Parvo lợn” của Xí nghiệp thuốc thú y TW, đây là loại vacxin vô hoạt có chất bổ trợ keo phèn, được sản xuất từ virus Parvo ở lợn nuôi cấy trên tế bào thận bào thai lợn. Các loại vacxin phòng PPV khác hiện đang lưu hành trên thị trường chủ yếu là vacxin nhập ngoại.
Trong danh mục vacxin, chế phẩm sinh học, vi sinh vật, hóa chất dùng trong thú y được phép lưu hành tại Việt Nam ban hành kèm theo Thông tư số 28/2013/TT-BNNPTNT ngày 31 tháng 05 năm 2013 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệp và PTNT, các vacxin phòng PPV nhập ngoại hiện đang lưu hành tại Việt Nam gồm có:
Porcilis Aujeszky + Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh giả dại và rối loạn sinh sản trên lợn.
Porcilis Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn.
Porcilis Ery+Parvo (Công ty Intervet – Hà Lan): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn.
Porcine parvovirus gene vaccine (Công ty Green Gross Veterinary Products – Hàn Quốc): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn.
PPV-VAC và Suishot Parvoguard (Công ty Choongang vaccine laboratory – Hàn Quốc): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn.
Parvoerysin (Công ty Bioveta, A.S – Đức): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn.
Parvosin - OL (Công ty Bioveta, A.S – Đức): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn.
Suvaxyn®P (Công ty Fort Dodge Animal Health – Mỹ nhập khẩu từ Brazil): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn.
Farrowsure B (Công ty Zoetis – Mỹ): Phòng bệnh đóng dấu lợn, rối loạn sinh sản, 6 chủng Lepto trên lợn.
Parvovax (Công ty Merial – Pháp): Phòng bệnh rối loạn sinh sản trên lợn. Parvosuin-Mr (Công ty Laboratories Hipra S.A – Tây Ban Nha): Phòng bệnh đóng dấu và rối loạn sinh sản trên lợn.
Parvo Shield L5E (Công ty Novartis – Thụy Sỹ): Phòng bệnh đóng dấu, rối loạn sinh sản và 5 chủng Lepto trên lợn.
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được tiến hành tại:
- Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1.
Địa chỉ: Phường Phương Mai – Đống Đa – Hà Nội. - Công ty TNHH Kyoto Biken Hanoi Laboratories.
Địa chỉ: Khu công nghiệp Thăng Long II – Yên Mỹ – Hưng Yên.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 4/2016 đến tháng 4/2017.
3.3. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
- Vacxin Kyoto Biken Porcine Parvovirus vô hoạt nhập từ Nhật Bản được sản xuất từ chủng 90HS-SK gây nhiễm trên tế bào SK-H tại công ty Kyoto Biken Laboratories Inc, Nhật Bản.
Mỗi liều vắc xin chứa ít nhất 2x107 TCID50 Porcine Parvovirus.
- Động vật thí nghiệm: lợn cái ở độ tuổi 150 ngày, là con lai giữa lợn đực Duroc với nái F1 (Landrace x Yorkshire), không có kháng thể chống Porcine Parvovirus.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Kiểm tra tính vô trùng, tính an toàn và hiệu lực của vacxin. - Đánh giá thời hạn bảo quản của vacxin.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Kiểm tra tính vô trùng của vacxin 3.5.1. Kiểm tra tính vô trùng của vacxin
Vacxin khi đưa vào sử dụng cho động vật cần đạt yêu cầu về tính vô trùng, vacxin không được nhiễm các vi sinh vật khác, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh. Thử nghiệm vô trùng có thể thực hiện bằng hai phương pháp: Phương pháp màng lọc và phương pháp cấy trực tiếp. Phương pháp màng lọc dùng một bơm chân không hút tất cả vacxin trong lọ cần kiểm tra đi qua một màng lọc có kích thước lỗ lọc nhỏ hơn hoặc bằng 0.45µm để giữ lại vi khuẩn và nấm trên màng, rửa màng lọc để loại bỏ hết các chất ức chế bằng cách cho các dung dịch rửa đi qua, sau đó nuôi cấy màng lọc trong các môi trường thích hợp cho vi khuẩn và nấm phát triển. Trong nghiên cứu này, phương pháp cấy trực tiếp được sử dụng để
kiểm tra tính vô trùng của vacxin. Sử dụng 2 loại môi trường là Thioglycolat (TGC) và Soybean Casein Digest (SCD) để kiểm tra.
-Môi trường TGC được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí. -Môi trường SCD được dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm.
Quy trình kiểm tra được áp dụng theo phương pháp thử vô trùng của vacxin và chế phẩm sinh học dùng trong thú y quy định trong TCVN 8684:2011.
3.5.1.1. Dụng cụ, thiết bị, nguyên vật liệu a. Dụng cụ, thiết bị
- Thìa cân, cốc cân/ giấy cân; - Ống đong;
- Chai thủy tinh có chia vạch;
- Ống nghiệm có đường kính 23x150mm; - Nút silicon xốp;
- Pipet thủy tinh vô khuẩn 10ml; - Giá đựng ống nghiệm;
- Khăn lau tẩm cồn; - Pipet aid;
- Cân phân tích;
- Máy khuấy từ gia nhiệt; - Lò hấp tiệt trùng. b. Nguyên vật liệu
- Nước tinh khiết Bulk Purified Water; - Bột Thioglycolat (TGC) (Hãng Merck);
- Bột Soybean Casein Digest (SCD) (Hãng Merck). 3.5.1.2. Tiến hành
a. Pha môi trường thử vô trùng - Tính lượng môi trường cần pha;
- Cân bột TGC và SCD theo tỷ lệ: 30g/1000ml; - Chuẩn bị chai đựng, dán nhãn, ghi ngày pha; - Cho 1/2 - 1/3 lượng nước vào từng chai.
TGC: sử dụng nước nóng khoảng 70oC. SCD: sử dụng nước ở nhiệt độ thường.
- Thêm lượng bột TGC và SCD đã cân vào từng chai đó.
- Thêm nốt lượng nước còn lại cho vừa đủ thể tích cần pha (nghiêng chai rót nước từ miệng chai xuống sao cho hòa tan nốt lượng bột còn dính trên thành chai).
- Cho nam châm vào, sử dụng máy khuấy từ thực hiện khuấy cho tan hoàn toàn.
- Dùng pipet hút 15ml TGC, SCD môi trường cho vào ống nghiệm, xếp ống nghiệm lên giá. Đạy nút silicon xốp sâu tới 2/3 nút.
Ghi nhãn đầy đủ các thông tin: Tên môi trường, ngày pha, hạn sử dụng - Hấp tiệt trùng môi trường đã chia trong các ống nghiệm ở 121oC trong 15 phút.
- Sau khi kết thúc quá trình tiệt trùng, để nguội môi trường ở nhiệt độ phòng. Môi trường đã pha có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng (15 - 25 oC) và sử dụng trong 3 tuần.
b. Quy trình thử vô trùng
Thử nghiệm vô trùng phải thực hiện dưới điều kiện hốt Biosafety Cabinet class II đạt cấp độ A, trong nền phòng sạch cấp độ B. Phòng sạch phải được kiểm soát áp xuất, nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ trao đổi khí và giám sát vi sinh. Người thực hiện được trang bị phương tiện bảo hộ vô trùng và tuân thủ mọi quy trình ra vào khu vực sạch.
- Lấy mẫu vacxin ra khỏi nơi bảo quản, lau cồn ngoài vỏ lọ vacxin trước khi chuyển vào Clean Bench.
- Thể tích mẫu vacxin được lấy để cấy:
Môi trường TGC: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử; 0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử. Môi trường SCD: 1ml mẫu/ ống x 2 ống thử; 0.5ml mẫu/ ống x 2 ống thử.
- Lắc đều mẫu vacxin, mở nắp lọ và dùng pipet thủy tinh hút mẫu vacxin vào ống môi trường. Lắc đều.
- Sử dụng 2 ống thử của mỗi loại môi trường TGC và SCD, cấy 1ml nước cất/ ống để làm đối chứng.
- Các ống môi trường TGC sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ 36 – 38oC, các ống môi trường SCD được nuôi ở nhiệt độ 20 – 25oC trong 14 ngày.
c. Đánh giá
Sau khi nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả ở các thời điểm 3 – 5 ngày, 7 – 9 ngày, 14 ngày sau khi cấy bằng các so sánh màu và độ đục của ống đã cấy mẫu vacxin và ống đối chứng cùng loại.
- Kết quả dương tính khi môi trường tạo váng, đục hoặc lắng cặn;
- Kết quả âm tính khi môi trường không có sự thay đổi về màu sắc và độ