3.4.1. Phương pháp nghiên cứu tổng quát
Khảo sát nấm Linh chi thu thập được ở Lào Cai, Ninh Bình, Thanh Hóa, Đà Lạt, Hưng Yên
↓
Tuyển chọn nấm Linh chi nguyên liệu có hoạt tính kìm hãm α-glucosidase cao. ↓
CHIẾT XUẤT AGIs TỪ NẤM LINH CHI
Ảnh hưởng của dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi ↓
Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi ↓
Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi ethanol và nấm Linh chi nguyên liệu đến khả năng chiết xuất AGIs
↓
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi ↓
AGIs từ nấm Linh chi ↓
Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm AGIs đến chất lượng chế phẩm AGIs
↓
Đánh giá chỉ tiêu chất lượng, cảm quan và an toàn thực phẩm của chế phẩm AGIs
↓
Ứng dụng chế phẩm chất chiết AGIs từ nấm Linh chi cho tạo thực phẩm chức năng
↓
Đề xuất quy trình chiết xuất chất chiết có khả năng kìm hãm α- glucosidase từ
nấm Linh chi
Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
3.4.2. Khảo sát, lựa chọn nấm Linh chi (Ganoderma Lucidium) nguyên liệu cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs) cho chiết xuất hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs)
Mẫu nấm Linh chi được tiến hành thu thập tại các hộ sản xuất ở 5 tỉnh khác nhau: Lào Cai, Hưng Yên, Thanh Hóa, Đà Lạt, Ninh Bình. Từ đó, xác định thành phần dinh dưỡng và hoạt tính AGIs của nấm Linh chi nguyên liệu:
- Độ ẩm (%)
- Hàm lượng: cellulose (%), lipid (%), protein (%), polysacharide hòa tan (mg%), β-glucan (mg%), triterpenoid (mg%),
- Hoạt tính AGIs (%)
=> Để chọn ra được mẫu nấm Linh chi tốt nhất để phục vụ các lần thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3. Phương pháp chiết xuất
3.4.3.1. Chiết xuất bằng dung môi khác nhau
Mỗi mẫu 500g nấm Linh chi (cỡ hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) chiết xuất với các dung môi khác nhau: ethanol 96%, methanol 96%, isopropyl alcohol 96%, nước cất. Chiết xuất cùng điều kiện là ở nhiệt độ 60ºC, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Dịch chiết được xác
định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.2. Chiết xuất bằng nồng độ dung môi khác nhau
Mỗi mẫu 500g nấm Linh chi (cỡ hạt 0,8 mm, độ ẩm 5%) được khảo sát xác định theo nồng độ dung môi chiết xuất AGIs: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 96%. Chiết xuất cùng điều kiện ở nhiệt độ 60ºC, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Dịch chiết được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.3. Chiết xuất bằng các nhiệt độ khác nhau
Mỗi mẫu 500g nấm Linh chi, được khảo sát xác định chiết xuất ở các nhiệt độ, gồm: 25; 35; 45; 55 và 65 ± 20ºC. Chiết xuất cùng điều kiện: Dung môi 50% ethanol, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20 kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Dịch chiết thô được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.4. Chiết xuất bằng các tỉ lệ khác nhau giữa nấm Linh chi nguyên liệu và dung môi
Mỗi mẫu khảo sát xác định tỷ lệ nấm Linh chi nguyên liệu/dung môi đến khả năng chiết xuất AGIs có tỷ lệ như sau: 1/6; 1/8; 1/10; 1/12; 1/14; 1/16; 1/18.
Chiết xuất cùng điều kiện ở nhiệt độ 60ºC, siêu âm cường độ 8W/cm2 ở tần số 20
kHz / bể siêu âm dung tích 20 lít, chiết xuất 6 phút. Lấy mẫu phân tích ở các thí nghiệm khảo sát với lượng mẫu tương ứng cùng lượng nấm Linh chi là 100 g, mẫu đem lọc thu dịch chiết và xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.3.5. Chiết xuất theo các mốc thời gian và cường độ sóng siêu âm khác nhau
Mỗi mẫu 500g nấm Linh chi, được khảo sát xác định chiết xuất ở các thời
gian và cường độ siêu âm khác nhau: 0 (không siêu âm), 2, 4, 6 và 8 W/cm2, thời
gian siêu âm chiết xuất là 0, 4, 8, 10, 12, 16, 18 và 22 phút. Chiết xuất cùng điều kiện: Dung môi 50% ethanol, tần số siêu âm 20kHz, bể siêu âm dung tích 20 lít. Dịch chiết thô được xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%).
3.4.4. Xác định điều kiện làm khô của chất chiết từ nấm Linh chi
3.4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ cô, sấy tạo chế phẩm đến chất lượng chế phẩm AGIs
Mỗi mẫu 1 lít dịch từ dịch chiết của nấm Linh chi (chiết xuất ở điều kiện:
nhiệt độ 60oC/ 10 phút siêu âm 20kHz với cường độ 8 W/cm2, chiết xuất ở tỷ lệ
định cô sấy ở các nhiệt độ khác nhau :50, 60,70, 80, 90 và 100±2ºC. Cô sấy cùng điều kiện - 0,8 atm, cao cô sấy khô đến độ ẩm 3,5%, được nghiền tạo chế phẩm AGIs, chế phẩm AGIs thu được đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase và cảm quan chế phẩm AGIs tạo ra.
3.4.4.2. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm AGIs để tạo bột uống liền AGIs
Bảng 3.2. Tỷ lệ phối trộn các thành phần tạo ra sản phẩm bột hoà tan dạng
Công thức Thành phần Tỉ lệ
% mg/túi (300mg)
W1
Stevioside 0,5 1,5
Chế phẩm AGIs Linh chi 50,0 150,0
Lactose 49,5 148,5
W2
Stevioside 1,5 4,5
Chế phẩm AGIs Linh chi 50,0 150,0
Lactose 48,5 145,5
W3
Stevioside 1,0 3,0
Chế phẩm AGIs Linh chi 50,0 150,0
Lactose 49,0 147,0
W4
Stevioside 2,0 6,0
Chế phẩm AGIs Linh chi 50,0 150,0
Lactose 48,0 144,0
W5
Stevioside 2,5 7,5
Chế phẩm AGIs Linh chi 50,0 150,0
Lactose 47, 5 142,5
Tiến hành thử nghiệm: Người thử: Số lượng 12 người. Tiêu chí lựa chọn người thử: Là người 18 - 45 tuổi. Không có bệnh về giác quan. Có tinh thần hợp tác. Không ăn các sản phẩm có vị mạnh, không hút thuốc trước khi tiến hành thí nghiệm 2 giờ. Không sử dụng các mỹ phẩm (son môi, nước hoa, xà phòng thơm) ngay trước khi làm thí nghiệm. Đến phòng thí nghiệm đúng giờ.
- Phép thử: Phép thử thị hiếu cho điểm thang 9 điểm thị hiếu. Mỗi công thức tạo bột uống liền được khảo sát có lượng mẫu là 100 túi/liều x 300 mg/túi, tiến hành trên 5 sản phẩm bột uống liền có thức W1, W2, W3, W4 và W5.
ngoài tầm quan sát của người thử. Tất cả các mẫu chuẩn bị phải giống nhau (cùng dụng cụ, cùng lượng sản phẩm, cùng dạng vật chứa…). Bột AGIs Linh chi
hoà tan sẽ được pha với nước cất ở nhiệt độ 900C, tỉ lệ 1 gói bột AGIs Linh chi
hoà tan (300 mg) / 100 ml nước. Mẫu sẽ được giữ ở nhiệt độ 500C và đem ra cho
người thử ở điều kiện nhiệt độ thí nghiệm.
- Cách thức trình bày mẫu: Mẫu được mã hóa bằng 3 chữ số ngẫu nhiên, thứ tự sắp xếp mẫu tuân theo hình vuông Williams.
Bảng 3.3. Mười trật tự trình bày mẫu tuân theo nguyên tắc hình vuông Williams tương ứng với 5 mẫu khảo sát
STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 STT Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 1 A B E C D 6 D C E B A 2 B C A D E 7 E D A C B 3 C D B E A 8 A E B D C 4 D E C A B 9 B A C E D 5 E A D B C 10 C B D A E Với A: là W3; B: là W4; C: là W1; D: là W5 và E: là W2
- Điều kiện thí nghiệm: Phép thử được tiến hành trong phòng thí nghiệm cảm quan tuân theo tiêu chuẩn ISO 8589. Phải đảm bảo sạch sẽ, không có mùi lạ, thoáng mát và yên tĩnh. Phòng thử được ngăn cách với khu chuẩn bị mẫu. Mỗi đợt 10 người thử. Độ chiếu sáng đồng nhất tại mọi vị trí trong phòng. Nhiệt độ
phòng duy trì ở nhiệt độ 20 ± 20C, độ ẩm tương đối từ 70 đến 85%.
- Tiến hành: Đánh giá cảm quan về mầu sắc, mùi, vị và trạng thái. Người thử nhận phiếu hướng dẫn. Người điều hành thí nghiệm giải thích cách tiến hành thí nghiệm cũng như nhiệm vụ của người thử. Người thử nhận lần lượt từng mẫu thử đựng trong ly thủy tinh đã mã hóa, cùng với phiếu trả lời tương ứng. Người thử thanh vị trước khi thử mẫu đầu tiên. Sau khi người thử đánh giá xong mẫu đó, thu lại phiếu trả lời cùng với mẫu cũ. Đưa mẫu tiếp theo cùng với phiếu trả lời tương ứng cho người thử, người thử cần thanh vị bằng nước lọc trước khi sử dụng mẫu tiếp theo. Sau khi người thử đánh giá xong 5 mẫu sẽ phát phiếu điều tra cho người thử.
3.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase theo Toomoyuki et al. (1999) Toomoyuki et al. (1999) Nguyên tắc: H O H O O O H O H O H O H N O2 H O H O O O H O H O O2N
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid α- D-glucose p-nitrophenol
Nguyên lý: Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase được thực hiện dựa trnee phản ứng
thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và
p-nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase.
Khi mẫu thử có hoạt tính kìm hãm enzyme α-glucosidase, sự tạo thanh hợp chất
p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang của p-nitrophenol so với mẫu đối
chứng, không bị ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang của p-nitrophenol sinh ra sau
phản ứng được đo ở bước sóng 405nm và được dùng để đánh giá hoạt động kìm hãm enzyme của mẫu thử.
Cách tiến hành:
Dịch chiết xuất bằng dung môi được lọc tách cặn. Phần dịch chiết được
đem đi cô bằng thiết bị cô chân không (ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm) để loại dung
môi, thu cao khô, hòa tan trở lại trong nước cất bằng lượng dịch chiết trước khi cô, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phương pháp của
Toomoyuki et al., 1999.
Cho 0,1 ml enzyme α-glucosidase được ủ với 0,05ml mẫu ở nhiệt độ 37oC
trong thời gian 10 phút.
Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phản ứng 0,05 ml pNPG nồng độ 4mM và ủ ở
nhiệt độ 37oC với thời gian 20 phút.
Sau cùng, phản ứng được kết thúc bằng việc bổ sung 1ml Na2CO3 0,2M.
Hoạt động ức chế của enzyme α-glucosidase được xác định bằng cách đo quang phổ (Thermo, Mỹ) ở bước sóng λ = 405 nm.
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được tính theo công thức :
%AGIs = (B-A) / B x 100 Trong đó:
B: Giá trị quang của mẫu đối chứng.
- Khả năng kìm hàm enzyme α- glucosidase cũng được đánh giá dựa trên giá trị IC50:
IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ của hoạt chất mà có thể kìm hãm
được 50% hoạt độ enzyme (trong trường hợp này là α-glucosidase) (theo phương
pháp của Jing et al. (2007). IC50 được xác định bằng cách khảo sát hoạt tính kìm
hãm của hoạt chất với enzyme ở các nồng độ khác nhau. Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta sẽ vẽ được một đường thẳng y = ax+b (với y là % hoạt tính kìm hãm và x là nồng độ). Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ kìm hãm trên và dưới 50% và cũng vẽ được đường thẳng y = ax+b. Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá
trị x, đó chính là IC50. Một số công trình nghiên cứu đã làm sáng tỏ rằng hoạt tính
kìm hãm α-glucosidase khác nhau khi sử dụng -glucosidase có nguồn gốc khác
nhau. Với mục tiêu là tạo được AGIs và ứng dụng cho bệnh nhân ĐTĐ nên
chúng tôi lựa chọn -glucosidase từ chuột cho các thí nghiệm định tính và định
lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.
3.4.6. Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh
3.4.6.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đông khô đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Sấy mẫu (ở nhiệt độ 105oC) trong thời gian dài để tách lượng
nước tự do và liên kết trong sản phẩm. Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng không đổi thì dừng sấy. Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết phần còn lại là chất khô.
Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:
Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g).
G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g).
G0: Khối lượng chén sứ (g).
3.4.6.2. Xác định hàm lượng lipit theo phương pháp soxhlet
Cân 5g mẫu đã nghiền nhỏ, cho vào ống giấy xốp hay gói bằng giấy cho vào tháp chiết xuất của máy Soxhlet (chú ý: đầu trên của ống giấy thấp hơn đỉnh ống xiphông của tháp chiết xuất).
Lắp bình cầu đã sấy khô vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung môi vào bình cầu. Lượng dung môi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hoặc hai lần dung tích tháp chiết xuất. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh.
- Chiết xuất chất béo
Đun từ từ dung môi trong bình cầu bằng bếp cách thủy (nếu dung môi là
CCl4 thì có thể đun trên bếp điện).
Dung môi sôi, bay hơi gặp lạnh, ngưng tụ ở tháp chiết xuất, trong thời gian này, dung môi sẽ chiết xuất chất béo, đến khi dung môi trong tháp chiết xuất vượt quá đầu ống xiphông sẽ tràn về bình cầu kéo theo chất béo, ta gọi là một chu trình. Dung môi lại tiếp tục bay hơi, còn chất béo do có nhiệt độ sôi cao hơn nên không bay hơi, còn chất béo do có nhiệt độ sôi cao hơn không bay hơi ở lại bình cầu, quá trình lại diễn ra tiếp tục.
Để tránh tổn thất dung môi, dung môi trong bình cầu không được sôi mạnh, đảm bảo khoảng 5 - 6 chu trình trong 1 giờ.
- Cất dung môi
Sau khi quá trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi tiến hành cất dung môi ngay trong tháp để thu hồi dung môi (trường hợp nếu dung môi trong bình cầu đục, có lẫn bột nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung môi). Chuyển chất béo trong bình cầu vào cốc thủy tinh (đã sấy khô và biết khối lượng). Tráng bình cầu bằng một ít dung môi trong cốc thủy tinh bay hơi ở nhiệt độ thường (chú ý tránh bụi).
Sau đó cho cốc thủy tinh vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105oC trong 1 giờ,
lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân, sấy tiếp trong 30 phút, sấy đến trọng lượng sai lệch nhau không quá 0,002gam là được.
- Hàm lượng chất béo trong mẫu tính bằng % theo công thức:
Chất béo = ((m2 – m1)/G)*100(%)
Trong đó: m1: khối lượng của cốc (g)
m2: khối lượng của cốc và khối lượng của chất béo sau khi sấy(g) G: khối lượng mẫu (g)
3.4.6.3. Xác định lượng protein theo phương pháp Kjelldahl
Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử (nghiền) theo TCVN 10787:2015.
Cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, nghiền mịn bằng máy nghiền. Chuyển mẫu đã nghiền vào lọ, đậy nắp và trộn kĩ.
- Cách tiến hành + Phân hủy mẫu
Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khô. Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác dạng bột hoặc dạng viên, trộn đều.
Thêm 20 ml axit sulfuric 98%, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 min. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl.
Để nguội dịch phân hủy. Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng axit dư đã bị thất thoát trong quá trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.
- Chưng cất
Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với 250 ml nước cất, thêm vật liệu chống sôi trào và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit boric.
Xoay mạnh bình để trộn nhanh lượng chứa trong bình và gia nhiệt đủ. Bật