Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase
Toomoyuki et al. (1999) Nguyên tắc: H O H O O O H O H O H O H N O2 H O H O O O H O H O O2N
p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid α- D-glucose p-nitrophenol
Ngun lý: Hoạt tính kìm hãm α-glucosidase được thực hiện dựa trnee phản ứng thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành đường glucose và
p-nitrophenol, hợp chất có màu vàng, dưới xúc tác của enzyme α-glucosidase.
Khi mẫu thử có hoạt tính kìm hãm enzyme α-glucosidase, sự tạo thanh hợp chất
p-nitrophenol sẽ giảm, do vậy mật độ quang của p-nitrophenol so với mẫu đối
chứng, không bị ức chế sẽ giảm theo. Mật độ quang của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo ở bước sóng 405nm và được dùng để đánh giá hoạt động kìm hãm enzyme của mẫu thử.
Cách tiến hành:
Dịch chiết xuất bằng dung môi được lọc tách cặn. Phần dịch chiết được
đem đi cô bằng thiết bị cô chân không (ở nhiệt độ 600C, - 0,8 atm) để loại dung
mơi, thu cao khơ, hịa tan trở lại trong nước cất bằng lượng dịch chiết trước khi cô, đem xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (%) theo phương pháp của Toomoyuki et al., 1999.
Cho 0,1 ml enzyme α-glucosidase được ủ với 0,05ml mẫu ở nhiệt độ 37oC
trong thời gian 10 phút.
Tiếp theo, cho vào hỗn hợp phản ứng 0,05 ml pNPG nồng độ 4mM và ủ ở
nhiệt độ 37oC với thời gian 20 phút.
Sau cùng, phản ứng được kết thúc bằng việc bổ sung 1ml Na2CO3 0,2M. Hoạt động ức chế của enzyme α-glucosidase được xác định bằng cách đo quang phổ (Thermo, Mỹ) ở bước sóng λ = 405 nm.
Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase được tính theo cơng thức :
%AGIs = (B-A) / B x 100 Trong đó:
B: Giá trị quang của mẫu đối chứng.
- Khả năng kìm hàm enzyme α- glucosidase cũng được đánh giá dựa trên giá trị IC50:
IC50 (Inhibitory concentration) là nồng độ của hoạt chất mà có thể kìm hãm được 50% hoạt độ enzyme (trong trường hợp này là α-glucosidase) (theo phương pháp của Jing et al. (2007). IC50 được xác định bằng cách khảo sát hoạt tính kìm hãm của hoạt chất với enzyme ở các nồng độ khác nhau. Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta sẽ vẽ được một đường thẳng y = ax+b (với y là % hoạt tính kìm hãm và x là nồng độ). Nếu hoạt lực kìm hãm enzyme của hoạt chất khơng biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ kìm hãm trên và dưới 50% và cũng vẽ được đường thẳng y = ax+b. Thay y = 50% vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là IC50. Một số cơng trình nghiên cứu đã làm sáng tỏ rằng hoạt tính
kìm hãm α-glucosidase khác nhau khi sử dụng -glucosidase có nguồn gốc khác
nhau. Với mục tiêu là tạo được AGIs và ứng dụng cho bệnh nhân ĐTĐ nên
chúng tôi lựa chọn -glucosidase từ chuột cho các thí nghiệm định tính và định
lượng hoạt tính kìm hãm α-glucosidase.