Phần 4 Kết quả và thảo luận
4.2 Điều kiện chiết xuất AGIs từ nấm linh chi
4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm
mơi là 1/18 thì cho khả năng AGIs cao nhất (71,91±0,91%). Khi chiết xuất từ tỉ lệ 1/6 đến 1/8 thì hoạt tính AGIs có sự tăng mạnh từ 67,57±0,69% lên đến 71,83±1,00%, tỉ lệ dung môi chiết xuất thấp nên cho hoạt tính kìm hãm α- glucosidase là thấp. Điều này có thể giải thích do lượng dung mơi sử dụng ít, khơng đủ xâm nhập vào tồn bộ nguyên liệu chiết xuất, không đủ cho sự khuếch tán chất tan (AGIs) vào dung môi (ethanol 50%). Hơn nữa, một lượng dung môi sẽ được giữ lại trong nguyên liệu nấm Linh chi là nguyên nhân làm hiệu quả thu nhận AGIs thấp. Khi gia tăng tỉ lệ dung môi sử dụng, sự chênh lệch nồng độ chất chất tan và cơ chất tăng, làm tăng tính tan và tăng sự khuếch tán. Vì thế làm tăng hoạt tính kìm hãm α- glucosidase trong q trình chiết xuất. Khi chiết xuất từ tỉ lệ 1/10 đến 1/18 thì hoạt tính AGIs từ 71,83±1,00% lên 71,91±0,91%, đây là một sự tăng lên không đáng kể, do mức độ pha loãng của AGIs trong dịch chiết xuất tăng. Qua đó, để đảm bảo hiệu suất chiết xuất cũng như tối thiểu các chi phí (dung mơi, năng lượng, …) chúng tôi lựa chọn tỷ lệ nấm Linh chi/dung môi chiết xuất là 1/10 làm kết quả cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi nấm Linh chi
Nhiệt độ chiết xuất có mối liên hệ với hiệu quả chiết xuất. Nhiệt độ tăng sẽ làm tăng số lượng bọt khí tạo thành, tuy nhiên cường độ vỡ bọt khí sẽ bị giảm do ảnh hưởng của áp suất hơi tăng lên và đóng vai trị như lớp đệm, ngăn cản sự va chạm của các phân tử xung quanh khi bọt khí vỡ. Ngược lại, sự vỡ bọt khí sẽ khó khăn khi giảm nhiệt độ, vì độ nhớt mơi trường tăng cao.
Sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ nhớt, quá trình vỡ bọt khí diễn ra mạnh mẽ hơn. Do đó, nhiệt độ phải được điều chỉnh sao cho gia tăng độ mạnh của sự vỡ bọt khí, tuy nhiên nhiệt độ cũng khơng được q cao để không giảm độ mạnh của sự vỡ bọt khí bởi áp suất hơi cao.
Nhiệt độ là một trong yếu tố ảnh hưởng lớn tới lượng AGIs tan trong dung môi chiết xuất. Nhiệt độ cao làm tăng tốc độ khuếch tán AGIs trong dung môi. Khi nhiệt độ chiết xuất càng cao sẽ làm cho độ xốp của nguyên liệu tăng lên (do nguyên
liệu trương nở), độ nhớt giảm và hoạt chất sẽ hịa tan dễ dàng trong dung mơi. Tuy nhiên khi nhiệt độ tăng quá cao sẽ làm giảm hiệu quả của q trình chiết xuất vì có thể xảy ra có phản ứng khác khơng cần thiết, như tăng độ tan của một số tập chất, thúc đẩy các biển đổi hóa học làm chất lượng dịch chiết biến đổi khơng có lợi.
Chúng tơi tiến hành thí nghiệm chiết xuất nấm Linh chi đã được nghiền nhỏ với ethanol theo tỷ lệ 1/10 trong 6 phút ở các khoảng nhiệt độ khác nhau: 25; 35; 45; 55 và 65±2ºC. Kết quả được thể hiện qua hình 4.4:
Hình 4.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến chiết xuất hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi (n = 3, α = 0,05)
Từ đồ thị hình 4.4. ta thấy khi chiết xuất ở các khoảng nhiệt độ khác nhau
thì khả năng AGIs khác nhau. Khi chiết xuất ở khoảng nhiệt độ 25oC đến 35oC
thì hoạt tính AGIs có sự tăng mạnh từ 60,87±0,93% lên 65,46±0,84%. Tuy nhiên ở khoảng nhiệt độ này, hoạt tính AGIs thu được là chưa cao, nguyên nhân là do ở
khoảng mức nhiệt độ 25-35oC khi xử lý sóng siêu âm với cường độ cao đã làm
cho cấu trúc nguyên liệu bị phá vỡ, nhung nhiệt độ lại chưa thể là làm cho dung
môi thẩm thấu vào nguyên liệu hiệu quả. Khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 35oC lên
45oC thì hoạt tính AGIs có sự tăng mạnh từ 65,46±0,84% lên 72,66±1,60%.
Nguyên nhân là ở nhiệt độ 45oC khi xử lý bằng sóng siêu âm với cường độ cao
đã làm cho cấu trúc nguyên liệu bị phá vỡ, đồng thời nhiệt độ tăng theo khả năng thẩm thấu của dung môi vào dung dịch được dễ dàng, hoạt tính AGIs thu được
lên không đáng kể (từ 72,66±1,60% lên 73,7±0,89%) do trong khoảng nhiệt độ này khả năng dung môi thẩm thấu vào nguyên liệu đã triệt để, nếu tăng nhiệt độ lên cao hơn thì khơng chỉ AIGs được chiết xuất mà lượng tạp chất không mong muốn cũng được chiết xuất ra Chính vì vậy, để tiết kiệm năng lượng và thời gian cho thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ phù hợp cho việc chiết xuất là
45±2oC và sử dụng nhiệt độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.2.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến khả năng chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi
Hình 4.5 cho thấy, khi chiết xuất khơng sử dụng sóng siêu âm thì ở thời gian 0 phút thu được hoạt tính AGIs thấp nhất là 35, 17%, còn ở thời gian 22 phút thì hoạt tính AGIs thu được cao nhất là 52, 74%. Chiết xuất sử dựng sóng siêu âm 20 kHz, ở thời gian 0 phút hoạt tính AGIs là 36,14%, thời gian 22 phút
thì thu được hoạt tính AGIs là 78,24%. Cường độ sóng siêu âm 4 W / cm2 cho
dịch chiết có hoạt tính AGIs nhỏ nhất là: 36,18% ở thời gian 0 phút và cao nhất
là 84, 27% ở thời gian 22 phút. Cường độ siêu âm 6 W/cm2 thu dịch chiết có
hoạt tính AGIs thấp nhất là 36,13%, cao nhất là 91,26% khi cô ở thời gian 22
phút. Cường độ siêu âm 8 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất 0 phút thì có
hoạt tính AGIs là 36,12%, khi chiết xuất đến 18 phút thì thu được hoạt tính AGIs là 96,15 %, sau tăng 22 phút siêu âm chiết xuất cho thấy hoạt tính AGIs tăng lần lượt tương ứng 96,24%, ở mức thời gian này cho thấy hoạt tính AGIs ở dịch chiết chênh lệch khơng nhiều so với mức thời gian 18 phút, trong khi đó ở
cường độ 6 W/cm2 hoạt tính AGIs cao nhất ở mức thời gian sau 24 phút. Phân
tích các kết quả (Hình 4.5) cho thấy các mốc thời gian ở các cường độ siêu âm được khảo sát là khi cường độ và thời gian siêu âm tăng thì càng cho khả năng chiết hoạt tính AGIs tăng cao, cao hơn nhiều so với đối chứng (không sử dụng sóng siêu âm, cho hoạt tính AGIs ở dịch chiết là thấp nhất), kết quả ở các mức cùng thời gian chiết xuất cho thấy khả năng chiết hoạt tính AGIs cao nhất ở
cường độ siêu âm là 8 W/cm2. Kết quả cho thấy sự tăng khả năng chiết xuất là do
ở cường độ siêu âm càng cao, càng tăng hiện tượng sủi bọt tạo lực phá vỡ cao, làm tăng tốc độ truyền khối của chất chiết. Ngoài ra, sự phá vỡ bọt cũng tạo sự khuấy trộn giúp cho khuyếch tán chất chiết bên trong ngun liệu thốt ra ngồi
dễ dàng hơn. Cường độ siêu âm 0, 2, 4 và 6 W/cm2 cho chiết hoạt tính AGIs tăng
cùng thời gian siêu âm chiết xuất tăng, ở các khảo sát thời gian siêu âm chiết xuất cho hoạt tính AGIs cao nhất ở 18 phút siêu âm chiết xuất, tuy nhiên ở cường độ
tăng, ở cường độ 8 W/cm2 với thời gian siêu âm chiết xuất khảo sát từ 0 - 6 phút cho chiết xuất nấm Linh chi tăng mạnh lên từ 6 đến 12 phút cho thấy chiết xuất hoạt tính AGIs tăng. Có thể giải thích là thời gian siêu âm càng dài, cường độ càng lớn, hạt nguyên liệu chiết xuất bị phá hủy càng nhiều thì độ nhớt và độ hịa tan càng tăng, chỉ số hòa tan tăng tương ứng với tăng cường độ và thời gian siêu âm. Độ nhớt cũng tăng khi cường độ và thời gian siêu âm tăng, nhưng khi cường độ đạt đên một giá trị nào đó làm độ nhớt giảm và khi số lượng các phân tử mạch ngắn nhiều hơn thì độ nhớt cũng tăng lên theo. Cường độ siêu âm cường độ cao có thể làm giãn bong bóng quá nhanh trong suốt chu kỳ áp suất âm do đó làm cho bong bóng khơng có cơ hội co rút trong chu kỳ áp suất dương. Ngược lại, khi cường độ siêu âm nhỏ hơn thì số lần bong bóng giãn ra và nén lại sẽ tăng lên. Do đó thời gian chiết xuất sẽ dài hơn. Cường độ sóng siêu âm càng mạnh thì khả năng chiết xuất hoạt chất cao ở thời gian càng ngắn hơn và sau thời gian nhất định càng tăng thời gian chiết xuất càng cho khả năng chiết hoạt tính AGIs cao. Điều này có thể ở thời gian chiết xuất kéo dài nhất định sẽ tăng các tạp chất hịa tan vào dung mơi chiết. Do đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí, mức thời gian 18 phút siêu âm chiết xuất ở cường độ siêu âm 8
W/cm2 được lựa chọn phù hợp nhất cho chiết hoạt tính AGIs từ Linh chi. Kết quả
cũng cho thấy năng lượng sóng siêu âm khi tăng cường độ sóng siêu âm phần lớn tăng khả năng chiết xuất hoạt tính AGIs từ nấm Linh chi.
Hình 4.5. Ảnh hưởng của thời gian và cường độ sóng siêu âm đến hoạt tính kìm hãm α-glucosidase (AGIs) của dịch chiết xuât từ nấm Linh chi (n = 3, α = 0,05)
số 20 kHz ở nhiệt độ 45 ± 20C trong 18 phút cho khả năng chiết xuất hoạt tính AGIs là 96,15 % và hoạt tính chống oxy hóa DPPH cao nhất (79,61 ± 3,13 %), cịn phương pháp chiết khơng sử dụng sóng siêu âm, chiết ở nhiệt độ 45 ± 20C trong 18 phút cho khả năng chiết xuất cho hoạt tính AGIs đạt 48,16 %, hoạt tính chống oxy hóa giảm (56,92 ± 4,84 %), khơng sử dụng sóng siêu âm ở nhiệt độ 45
± 20C trong 120 phút (2 giờ) cho khả năng chiết đạt 85,36 ± 0,039 % hoạt tính
tinh AGIs và hoạt tính chống oxy hóa chỉ đạt 59,68 ± 3,15 %, cho thấy chiết khơng sử dụng sóng siêu âm đều cho khả năng chiết hoạt chất AGIs thấp và hoạt
tính chống oxy hóa thấp hơn so với chiết xuất ở cường độ siêu âm 8w/ cm2 với
thời gian 18 phút khả năng chiết xuất hoạt chất AGIs cao hơn (khoảng 10,79 %) so với chiết xuất khơng có siêu âm trong 2 giờ. Cho thấy năng lượng sóng siêu âm đem lại hiệu quả chiết xuất hoạt chất AGIs từ nấm Linh chi cao.
Bảng 4.3. So sánh phương pháp chiết xuất AGIs từ nấm Linh chi bằng sử dụng sóng siêu âm và khơng sử dụng sóng siêu âm
Chỉ tiêu Đơn vị
Phương pháp chiết xuất AGIs Sóng siêu âm
cường độ 8W/cm2 /20 kHz
khơng sử dụng sóng siêu âm
Tỷ lệ dung môi ethanol 50% : bột bột
nấm lin chi w:w 10 10 10
Nhiệt độ chiết xuất oC 45 ± 2 45 ± 2 45 ± 2
Thời gian chiết xuất phút 18 18 120
Hoạt tính AGIs % 96,15 ± 0,51 48,16 ± 0,45 85,36 ± 0,62 Hoạt tính chống oxy
hóa (DPPH) % 79,61 ± 3,13 56,92 ± 4,84 59,68 ± 3,15 Hoạt lực kìm hãm α-
glucosidase (IC50) μg/ml 210 ± 5,57 340 ± 7,37 217 ± 8,14