Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.6 Phương pháp xác định chỉ tiêu hóa sinh
3.4.6.1. Phương pháp xác định độ ẩm
Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đông khô đến khối lượng không đổi
Nguyên tắc: Sấy mẫu (ở nhiệt độ 105oC) trong thời gian dài để tách lượng
nước tự do và liên kết trong sản phẩm. Trong quá trình sấy cần theo dõi và cân khối lượng mẫu đến khi khối lượng khơng đổi thì dừng sấy. Lượng nước trong nguyên liệu đã bay hết phần cịn lại là chất khơ.
Độ ẩm (W%) được tính theo công thức sau:
Trong đó: G1: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi sấy (g). G2: Khối lượng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g). G0: Khối lượng chén sứ (g).
3.4.6.2. Xác định hàm lượng lipit theo phương pháp soxhlet
Cân 5g mẫu đã nghiền nhỏ, cho vào ống giấy xốp hay gói bằng giấy cho vào tháp chiết xuất của máy Soxhlet (chú ý: đầu trên của ống giấy thấp hơn đỉnh ống xiphông của tháp chiết xuất).
Lắp bình cầu đã sấy khơ vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung mơi vào bình cầu. Lượng dung mơi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hoặc hai lần dung tích tháp chiết xuất. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh.
- Chiết xuất chất béo
Đun từ từ dung mơi trong bình cầu bằng bếp cách thủy (nếu dung mơi là CCl4 thì có thể đun trên bếp điện).
Dung môi sôi, bay hơi gặp lạnh, ngưng tụ ở tháp chiết xuất, trong thời gian này, dung môi sẽ chiết xuất chất béo, đến khi dung môi trong tháp chiết xuất vượt q đầu ống xiphơng sẽ tràn về bình cầu kéo theo chất béo, ta gọi là một chu trình. Dung mơi lại tiếp tục bay hơi, cịn chất béo do có nhiệt độ sơi cao hơn nên không bay hơi, cịn chất béo do có nhiệt độ sơi cao hơn khơng bay hơi ở lại bình cầu, quá trình lại diễn ra tiếp tục.
Để tránh tổn thất dung môi, dung môi trong bình cầu khơng được sơi mạnh, đảm bảo khoảng 5 - 6 chu trình trong 1 giờ.
- Cất dung mơi
Sau khi q trình chiết kết thúc, bỏ túi giấy lọc ra rồi tiến hành cất dung môi ngay trong tháp để thu hồi dung mơi (trường hợp nếu dung mơi trong bình cầu đục, có lẫn bột nghiền thì phải lọc qua giấy lọc rồi mới cất thu hồi dung môi). Chuyển chất béo trong bình cầu vào cốc thủy tinh (đã sấy khơ và biết khối lượng). Tráng bình cầu bằng một ít dung mơi trong cốc thủy tinh bay hơi ở nhiệt độ thường (chú ý tránh bụi).
Sau đó cho cốc thủy tinh vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 100-105oC trong 1 giờ,
lấy ra để nguội ở bình hút ẩm và cân, sấy tiếp trong 30 phút, sấy đến trọng lượng sai lệch nhau không quá 0,002gam là được.
- Hàm lượng chất béo trong mẫu tính bằng % theo cơng thức: Chất béo = ((m2 – m1)/G)*100(%)
Trong đó: m1: khối lượng của cốc (g)
m2: khối lượng của cốc và khối lượng của chất béo sau khi sấy(g) G: khối lượng mẫu (g)
3.4.6.3. Xác định lượng protein theo phương pháp Kjelldahl
Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu thử (nghiền) theo TCVN 10787:2015.
Cân khoảng 20 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g, nghiền mịn bằng máy nghiền. Chuyển mẫu đã nghiền vào lọ, đậy nắp và trộn kĩ.
- Cách tiến hành + Phân hủy mẫu
Cân từ 1,0 đến 1,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị, chính xác đến 1 mg, chuyển định lượng vào bình Kjeldahl khơ. Thêm khoảng 10 g hỗn hợp xúc tác dạng bột hoặc dạng viên, trộn đều.
Thêm 20 ml axit sulfuric 98%, xoay nhẹ bình để trộn và làm ẩm lượng chứa trong bình. Tiến hành phân hủy mẫu ở nhiệt độ thấp cho đến khi ngừng tạo bọt. Đun sôi hỗn hợp đến khi xuất hiện màu nâu, đun tiếp trong 30 min. Không để nguồn nhiệt tiếp xúc trực tiếp với bình ở phía trên mức chất lỏng và phải quan sát thấy hơi nước hồi lưu tại vùng thấp của cổ bình Kjeldahl.
Để nguội dịch phân hủy. Nếu lượng chứa trong bình bị hóa rắn chứng tỏ lượng axit dư đã bị thất thốt trong q trình phân hủy và amoni sulfat có thể đã hóa hơi.
- Chưng cất
Cẩn thận pha loãng dịch phân hủy với 250 ml nước cất, thêm vật liệu chống sôi trào và thêm từ từ khoảng 70 ml dung dịch natri hydroxit để tạo thành hai lớp rõ rệt. Lắp bình với ống bảo vệ và nối với bộ sinh hàn, chú ý không làm xáo trộn các lớp chất lỏng. Đầu ra của bộ sinh hàn phải nhúng ngập trong dung dịch axit boric.
Xoay mạnh bình để trộn nhanh lượng chứa trong bình và gia nhiệt đủ. Bật sẵn thiết bị gia nhiệt trước khi nối bình, để giảm thiểu nguy hiểm do chất lỏng chảy ngược trở lại qua sinh hàn. Ngay sau khi trộn, cần tháo bình chứa axit boric để làm khơ đầu ra của bình sinh hàn và để cân bằng áp suất trong bình chưng cất.
Chưng cất amoniac vào lượng dư axit boric nồng độ 20 g/lit (khoảng 25 ml), có chứa 0,5 ml chất chỉ thị. Lấy khoảng 180 ml dịch chưng cất và chuẩn độ amoniac bằng dung dịch axit chuẩn độ. Điểm kết thúc chuẩn độ đạt được khi dung dịch chuyển sang màu xám.
- Mẫu trắng
Thực hiện mẫu trắng thuốc thử, dùng 1,000 g sacarose thay cho phần mẫu thử. - Tính và biểu thị kết quả
+ Hàm lượng nitơ tổng số
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Cơng thức (1):
XN1 = (%) (1)
Hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, XN2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khơ, được tính theo Cơng thức (2):
XN2 = x x 100 (%) (2)
Trong đó:
V là thể tích dung dịch axit chuẩn độ cần để trung hòa amonia sau
khi trừ giá trị tương ứng của mẫu trắng, tính bằng mililit (ml);
0,0014 là số gam nitơ tương ứng với 1 ml dung dịch axit chuẩn độ (axit
clohydric 0,1 M hoặc axit sulfuric 0,05 M);
m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);
w là độ ẩm của phần mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng, xác
định được theo TCVN 10788:2015. Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân. + Hàm lượng protein tổng số
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP1, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo Cơng thức (3):
XP1 = XN1 x 6,25 (3)
Hàm lượng protein tổng số của mẫu thử, XP2, biểu thị theo phần trăm khối lượng chất khơ, được tính theo Cơng thức (4):
XP2 = XN2 x 6,25 (4) Trong đó:
XN1 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm
XN2 là hàm lượng nitơ tổng số của mẫu thử, tính bằng phần trăm khối lượng chất khơ, theo Cơng thức (2);
6,25 là hệ số chuyển đổi từ hàm lượng nitơ tổng số sang hàm lượng
protein.
3.4.6.4. Phương pháp xác định hàm lượng cellulose
Cân chính xác 1-2 g nấm Linh chi cho vào bình tam giác 200ml dung dịch NaOH 0,5%, lắp vào ống sinh hàn đun hoàn lưu trong 30 phút kể từ lúc sôi. Chú ý đừng để bọt trào lên.
Lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly tâm. Rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0,5% nóng. Tiếp tục cho cặn tác dụng với 10ml HCl 10%. Thêm vào đó 10ml dung dịch natri hypochlorite từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều. Để yên trong 5 phút rồi lọc qua giấy lọc đã biết trọng lượng hoặc ly
tâm. Cho cặn lại tiếp tục tác dụng trở lại với NaOH 0,5% ở nhiệt độ 40oC. Để
yên vài phút và ly tâm. Làm như thế 1-2 lần nữa để có cellulose thật trắng. Sau cùng rửa sạch thật kỹ bằng nước sôi. Sấy khơ và cân.
Tính kết quả
Hàm lượng cellulose được tính theo cơng thức sau: X
Trong đó:
a: trọng lượng cellulose (g)
m: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)
3.4.6.5. Phương pháp xác định hàm lượng β-glucan (XiaoPing C. et al, 2010)
Lượng β- Glucan được xác định bằng phương pháp phenol-sulfuric.
Phương pháp phenol-sulfuric xác định Beta-Glucaldựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 490 nm của phức chất tạo bởi phenol và cacbohydrate. Hàm lượng Beta-Glucal được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn. Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 490 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích. Tùy từng điều kiện phương pháp phenol - sulfuric có độ chính xác đến ± 2%.
* Xây dựng đường chuẩn
- Pha phenol 5%: Cân 5g phenol, hịa tan trong bình định mức 100ml bằng nước cất, sau khi phenol tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức.
- Cân 1g D-glucose tinh khiết (chất chuẩn), hịa tan trong bình định mức 1lít bằng nước cất sau khi glucose tan hết ta thêm nước cất đến vạch định mức. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ 1mg/ml (1000ppm).
- Từ dung dịch chuẩn ta pha thành dãy chuẩn với các nồng độ: 0,2mg/ml; 0,1mg/ml; 0,05mg/ml; 0,02mg/ml; 0,01mg/ml; tương ứng với các nồng độ 200ppm; 100ppm; 50ppm; 20ppm; 10ppm.
- Lấy 5ml mỗi nồng độ chất chuẩn đưa vào các lọ 10ml.
- Thêm lần lượt vào tất cả các lọ chuẩn 0,5ml dung dịch phenol 5% sau đó thêm lần lượt vào tất cả các lọ 2,5ml dung dịch H2SO4 96%.
Chuyển dãy chuẩn ra các cuvet và đo độ hấp thụ quang học ở bước sóng là 490 nm.
* Kết quả xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn Beta-Glucalđược dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1. Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ chất chuẩn. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa Beta-Glucalvà OD490nm là
y = 0,006x + 0,0369
Trong đó x là hàm lượng Beta-Glucaltrong 1 ml dịch(mg/ml), y là giá trị OD490nm tương ứng. Hệ số tương quan R2 = 0,9995 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là chặt chẽ.
Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y =0,006x + 0,0369 và kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 490 nm của các mẫu phân tích, xác định được nồng độ của các mẫu phân tích. Hàm lượng Beta-glucan được xác đinh thơng qua cơng thức dưới đây.
* Tính tốn xác định hàm lượng β- glucan trong sinh khối nấm Linh chi - Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích.
- Hàm lượng glucan được tính theo cơng thức sau:
Hàm lượng glucan (%) = ×100 (%)
Trong đó
V: thể tích dịch chiết xuất (ml) n: là hệ số pha loãng
m: là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích (g)
3.4.6.6. Phương pháp xác định hàm lượng tritepennoid (Chihara G, 1970)
Lượng trietrpenoid được xác định bằng phương pháp đo mật độ chiết quang Phương pháp đo mật độ chiết quang dựa trên việc hấp thụ tại bước sóng 548,1 nm. Hàm lượng triterpenoid được xác định bằng cách so sánh với một đường chuẩn. Sử dụng máy quang phổ hấp thụ, chọn bước sóng 548,1 nm, xây dựng đường chuẩn, đo các mẫu phân tích.
* Xây dựng đường chuẩn
Quy trình lập đường chuẩn triterpenoid như sau:
- Cân chính xác 1,15 mg axit ursolic, hịa tan trong 10 ml ethyl acetate để xây dựng đường chuẩn với các nồng độ axit ursolic là 0; 0,20; 0,40; 0,60; 0,80; 1
và 1,20 mg dung dịch được làm khô ở 100oC.
- Sau đó thêm 0,40 ml dung dịch axit axetic và vanillin 5% -1 ml axit
pecloric, ở 60oC trong 15 phút sau đó di chuyển nó vào bồn nước đá, thêm 5 ml
axit axetic, đặt nó ở nhiệt độ phịng trong 15 phút. - Xác định độ hấp thụ của nó trong 548,1 nm.
Vẽ đường chuẩn dựa trên kết quả xác định. Trọng lượng tiêu chuẩn trong phạm vi 0-0,14 mg cho thấy một mối quan hệ tuyến tính tốt với giá trị hấp thụ.
* Kết quả xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn triterpenoid được dựng nhờ chương trình Microsoft Excel được thể hiện ở phụ lục 1. Với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ chất chuẩn. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa triterpenoid và OD 548,1nm là:
y = 0,0955x – 0,094
Trong đó y là hàm lượng triterpenoid trong 1 ml dịch (mg/ml), x là giá trị OD548,1nm tương ứng. Hệ số tương quan r = 0,9996 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là chặt chẽ.
Dựa vào đường chuẩn, phương trình đường chuẩn y = 0,0955x - 0,0904 và kết quả đo quang phổ hấp thụ tại bước sóng 548,1nm của các mẫu phân tích, xác
định được nồng độ của các mẫu phân tích. Hàm lượng triterpenoid được xác đinh thơng qua cơng thức dưới đây.
* Tính tốn xác định hàm lượng triterpenoid trong sinh khối nấm Linh Chi - Từ đường chuẩn xác định được nồng độ mẫu phân tích.
- Hàm lượng triterpenoid được tính theo cơng thức sau:
Hàm lượng triterpenoid (%) = x 100 (%)
Trong đó:
X: số gam xác định từ đường chuẩn (g/ml) V: thể tích dịch chiết xuất (ml)
n: là hệ số pha loãng
m: là khối lượng mẫu ban đầu đem phân tích (g)
3.4.6.7. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp qut gốc tự do DPPH
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp quyét gốc tự do DPPH theo phương pháp của Shimada et al. (1992). DPPH là gốc tự do ổn định, không tự kết hợp đề tạo thành nhị nhân tử. Gốc tự do có màu tím nhờ vào điện tử N chưa ghép đơi. Chất có tác dụng chống oxi hóa sẽ làm giảm màu của 1,1- diphenyl 1-2-picrylhydrazyl (DPPH). Sự mất hoặc giảm màu này là do các gốc tự do DPPH đã kết hợp với một H của chất nghiên cứu để tạo thành DPPH dạng nguyên tử. Hoạt tính quét gốc tự do của chất nghiên cứu tỉ lệ thuận với độ mất màu của DPPH. Xác định bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 515 nm.
Dung dịch DPPH: cân 3,94mg DPPH định mức bằng ethanol 99.7% thành 10000 µL được dung dịch trữ DPPH 1000 µM. Lấy 500 µL dung dịch trữ định mức thành 50ml được dung dịch DPPH 100 µM (dung dịch làm việc).
- Dung dịch làm việc của mẫu DPPH có nồng độ 500 µM.Dung dịch mẫu
dịch chiết xuất được lấy 1ml mỗi mẫu rồi đưa lên cùng thể tích 10 ml bằng dung môi là nước.
- Mẫu thử và mẫu control được pha như sau:
+ Mẫu control: 1500µL ethanol 99.7%, 1500µL DPPH mẫu;
900µL ethanol 99.7%, 1500 µL DPPH mẫu;
+ Mẫu thử 50 µM: 300µL mẫu dịch chiết xuất đã đưa về cùng thể tích, 1200µL ethanol 99.7%, 1500 µL DPPH mẫu;
+ Mẫu thử 25 µM: 150µL mẫu dịch chiết xuất đã đưa về cùng thể tích, 1350µL ethanol 99.7%, 1500 µL DPPH mẫu;
+ Mẫu thử 10 µM: 60µL mẫu dịch chiết xuất đã đưa về cùng thể tích, 1440µL ethanol 99.7%, 1500 µL DPPH mẫu.
Ủ hỗn hợp trong bóng tối 30 phút ở 4ºC. Dung dịch sau ủ được đo mật độ quang ở bước sóng 517nm. Mỗi mẫu ban đầu được thử với 4 nồng độ khác nhau như trên. Mỗi nồng độ tiến hành 3 lần ta được 3 giá trị ức chế. Lấy trung bình 3 giá trị đó ta xác định được giá trị % ức chế với từng nồng độ khảo sát.
- Kết quả hoạt tính chống oxy hóa được biểu thị bằng % kìm hãm DPPH
theo cơng thức:
HTCO (%) = [(ODcontrol - ODmẫu) / ODcontrol] × 100 (%) Trong đó:
ODcontrol: Độ hấp thụ quang của mẫu control (const); ODmẫu: Độ hấp thụ quang của mẫu cần xác định; HTCO(%): Hoạt tính chống oxy hóa.
3.4.6.8. Phương pháp định lượng polysaccharide trong nấm linh chi theo phương pháp UV - VIS (Foster and Cornelia, 1961)
- Nguyên tắc: Phương pháp quang phổ UV - VIS là phương pháp phân tích dựa trên việc đo độ hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch nghiên cứu ở bước sóng trong vùng tử ngoại - khả kiến. Định lượng polysaccharide dựa vào đặc tính tạo màu đặc trưng của các hợp chất thuộc polysaccharide với phenol trong môi trường H2SO4 đậm đặc sẽ cho ra màu vàng đặc trưng. Phương pháp thường được sử dụng để khảo sát các hợp chất polysacharide trong các trường hợp chất thiên nhiên.
- Cách tiến hành:
+ Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,4g chuẩn glucose vào bình định mức 100ml, thêmnước cất, lắc cho tan, bổ sung vừa đủ thể tích bằng nước cất, lắc đều được dung dịch chuẩn glucose có nồng độ 4mg/ml. Xây dựng đường
chuẩn bằng dung dịch chuẩn vừa pha.