3.4.1. Đánh giá đặc tính sinh học của các chủng giống vi sinh vật
3.4.1.1. Xác định hoạt tính enzyme của vi sinh vật theo phương pháp khuếch tán phóng xạ trên đĩa thạch (William, 1983)
Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy vi sinh vật trên 9ml dung dịch môi trường chuyên tính với 1 vòng que cấy chứa vi sinh vật, đưa lên máy lắc ở 150 vòng/phút. Sau 72 giờ đối với vi khuẩn, 96 giờ đối với nấm và xạ khuẩn, dịch nuôi cấy được đánh giá khả năng phân giải enzym.
Chuẩn bị môi trường: Đánh giá hoạt tính 3 loại enzym: amylaza, proteaza, xenlulaza của vi sinh vật.
Enzym Amylaza Proteaza Xenlulaza
Hóa chất Tinh bột Thạch Casein Thạch Xenluloza Thạch
Định lượng 0,2% 1,5% 0,3% 1,5% 0,2% 1,5%
Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C, áp suất 1 atm trong vòng 20 phút. Để nhiệt độ giảm đến khoảng 55-60°C thì đổ ra các đĩa peptri với chiều dày 2mm rồi để nguội. Các đĩa peptri trước khi đổ môi trường được sấy ở 170°C trong 2 giờ để khử trùng.
Dùng ống nghiệm đã khử trùng có đường kính 11mm đục lỗ trên các đĩa thạch. Nhỏ 2ml dịch chiết đã nuôi ở trên vào lỗ thạch, sau đó để trong tủ lạnh 6h cho dịch khuếch tán vào trong thạch rồi đem nuôi ở 30°C trong vòng 48h. Lấy ra và nhuộm màu bằng thuốc thử lugol để đo vòng phân giải.
Đường kính vòng phân giải D = d2-d1, trong đó D là đường kính vòng phân giải enzym của vi sinh vật, d2 là đường kính cả vòng phân giải, d1 là kích thước của lỗ đục (d1= 11mm).
3.4.1.2. Đánh giá khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật
Nuôi dịch chiết của chủng vi sinh vật sau đó pha loãng trong các ống nghiệm chứa nước vô trùng đến nồng độ thích hợp, tiến hành cấy trên các môi trường chuyên tính bằng cách nhỏ 0,1 ml dịch chiết lên trên bề mặt thạch và sử dụng que gạt để chang đều, gói lại và đem nuôi ở các mức nhiệt độ khác nhau: 28°C, 40°C, 50°C, 60°C và đếm số lượng khuẩn lạc hình thành trên đĩa peptri. 3.4.1.3. Xác định khả năng thích ứng pH của vi sinh vật
Nuôi dịch chiết của chủng vi sinh vật sau đó pha loãng trong các ống nghiệm nước vô trùng đến nồng độ thích hợp, tiến hành chang đều 0,1ml dịch lên trên các môi trường chuyên tính đã chuẩn bị ở 5 mức pH khác nhau: 5, 6, 7, 8, 9 bằng dung dịch đệm pH (pha bằng Na2HPO4 và KH2PO4, đo và chỉnh pH của dung dịch bằng máy đo pH). Sau đó đem nuôi ở 28°C rồi đếm số lượng khuẩn lạc tạo thành.
3.4.1.4. Xác định khả năng sinh trưởng trên các nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ của vi sinh vật
Nuôi dịch chiết của chủng vi sinh vật sau đó pha loãng trong các ống nghiệm nước vô trùng đến nồng độ thích hợp, tiến hành chang đều 0,1ml dịch lên trên các môi trường chuyên tính có thành phần đã được thay thế bằng các nguồn
dinh dưỡng chứa C, N khác nhau nhưng lượng không thay đổi. Đối với môi trường có nguồn dinh dưỡng C thay thế bằng: glucozo, manitol, saccarozo, tinh bột. Đối với nguồn dinh dưỡng N thay bằng: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4, KNO3. Nuôi ở 28°C sau đó đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa peptri.
3.4.1.5. Phân loại sơ bộ vi sinh vật bằng phương pháp quan sát theo khóa phân loại và phản ứng sinh hóa đặc trưng của Cambel (1971), Schipper (1979), Petter (1991), Klicike (2004) và Bergey’s (2009)
3.4.1.6. Đánh giá tính đối kháng của các chủng giống VSV tuyển chọn bằng phương pháp đường vuông góc Cross Streak