2.6.3.1. Phản ứng trung hoà vi rút
Phản ứng trung hòa vi rút hiện nay được coi là “tiêu chuẩn vàng” để phát hiện kháng thể đến protein cấu trúc của vi rút LMLM và cũng là xét nghiệm bắt buộc đối với chứng nhận xuất nhập khẩu của động vật và sản phẩm động vật (OIE, 2019). Phản ứng này dùng chẩn đoán trong các trường hợp bị bệnh nhẹ, không điển hình, phải lấy máu chắt huyết thanh để tìm kháng thể. Phản ứng trung hòa có tính đặc hiệu cao, nhạy và nhanh chóng.
Phản ứng trung hoà vi rút thực hiện trên môi trường tế bào IB-RS2, BHK- 21, tế bào thận lợn hoặc thận cừu được nuôi trong các đĩa nhựa giếng nhỏ đáy bằng. Để xác định type gây bệnh, cho huyết thanh của gia súc nghi mắc bệnh vào 7 ống nghiệm, sau đó cho vào mỗi ống nghiệm từng type vi rút LMLM đã biết với hiệu giá vi rút đã được xác định là 100 TCID50 (50% Tissue Culture Infectious Dose) một lượng tương đương với huyết thanh nghi, rồi cho vào tủ ấm 37oC trong khoảng 1 giờ để kháng nguyên và kháng thể tác động với nhau. Sau đó dùng hỗn dịch của từng ống nghiệm cấy vào các dãy giếng nhựa đã nuôi cấy tế bào, đồng thời các giếng đối chứng âm không cấy hỗn dịch mà để tế bào tiếp tục phát triển và các giếng đối chứng dương cấy các type vi rút LMLM tiếp tục để tủ ấm 37C trong vòng 2 - 3 ngày.
2.6.3.2. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA là một phản ứng dùng để chẩn đoán nhanh bệnh LMLM và để giám định type huyết thanh của vi rút. Phản ứng này được sử dụng thay thế phản ứng kết hợp bổ thể (CFT) vì nó có độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, không bị ảnh hưởng của các yếu tố tăng cường hoặc ức chế bổ thể (Nguyễn Đăng Khải và cs.,
2000). Phản ứng này được xác nhận có độ nhạy gấp 125 lần so với phản ứng CFT và có độ đặc hiệu cao khi dùng với một kháng thể đơn dòng, phản ứng cũng có độ nhạy cao trong chẩn đoán và định type vi rút. Tuy nhiên, ELISA cho kết quả dương tính khoảng 70 - 80% đối với mẫu biểu mô của gia súc nghi mắc bệnh do thiếu độ nhạy. Do vậy, vi rút cần được nhân lên trong môi trường tế bào và sau đó xét nghiệm bằng ELISA để phát hiện vi rút và xác định chắc chắn type huyết thanh (Hamblin et al., 1987).
Phản ứng 3ABC-ELISA
Hiện nay, trong xét nghiệm chẩn đoán thường sử dụng phản ứng 3ABC- ELISA để chẩn đoán phân biệt huyết thanh dương tính là do nhiễm vi rút thực địa hay do vắc xin. Cơ sở khoa học của phương pháp này là khi vi rút LMLM nhiễm vào cơ thể gia súc, quá trình nhân lên của vi rút sẽ diễn ra. Trong quá trình nhân lên của vi rút trong tế bào gây nhiễm tạo ra 2 loại protein, loại protein sớm được tổng hợp trước, đó là các enzym dùng trong quá trình sinh tổng hợp như ARN polymeraza, protein ức chế… loại protein này không tham gia vào cấu trúc của hạt vi rút nên gọi là protein phi cấu trúc (non-structure protein). Loại protein thứ 2 được sinh ra muộn hơn nó chính là các đơn vị cấu trúc để tạo nên các capxom và hình thành capxit vi rút, nên được gọi là protein cấu trúc (structure protein).
Trong các protein phi cấu trúc của vi rút LMLM thì kháng nguyên 3ABC có tính kháng nguyên rất cao, nó kích thích cơ thể gia súc tạo ra kháng thể đặc hiệu với số lượng lớn và tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh trâu bò bị nhiễm. Do đó, việc phát hiện kháng thể đặc hiệu 3ABC cho phép kết luận gia súc đã bị nhiễm vi rút LMLM. Đây là phản ứng có độ đặc hiệu và độ nhạy cao để nhận diện kháng huyết thanh dương tính.
Tuy nhiên, trong các loại vắc xin vô hoạt LMLM của các hãng Intervet (Hà Lan) và Merial (Pháp) những kháng nguyên phi cấu trúc đã được loại bỏ (gọi là vắc xin tinh khiết). Sau khi tiêm cho gia súc chỉ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể chống lại kháng nguyên cấu trúc (hạt vi rút) chứ không có kháng thể chống lại kháng nguyên phi cấu trúc 3ABC.
Một số loại vắc xin khác (ví dụ: vắc xin đơn giá type O và hai type O-Asia1 của Trung Quốc) là vắc xin không tinh khiết, do đó, dùng phản ứng 3ABC-- ELISA sẽ không xác định chắc chắn gia súc nhiễm vi rút LMLM thực địa hay do tiêm vắc xin không tinh khiết. Việc kết luận gia súc mắc bệnh hay do tiêm vắc
xin phải kết hợp với xét nghiệm bằng phản ứng trung hòa vi rút và điều tra lịch sử tiêm phòng vắc xin (Tô Long Thành, 2000).
Phản ứng LPB-ELISA (Liquid Phase Blocking-ELISA)
Phản ứng LPB-ELISA được dùng để phát hiện kháng thể. Đây là một phản ứng nhanh, nhạy và đặc hiệu có thể cho kết quả trong vòng 24 giờ. Phản ứng này có thể định tính và định lượng kháng thể của gia súc bị nhiễm bệnh tự nhiên hay tiêm phòng vắc xin LMLM. So với phản ứng trung hòa thì phản ứng LPB-ELISA có nhiều ưu điểm hơn và được áp dụng nhiều hơn, thay thế cho phản ứng trung hòa.