3.3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Các ổ dịch và loài gia súc mắc bệnh LMLM tại các địa phương trong thời gian từ 2016 - 2018.
- Các chủng vi rút LMLM phân lập được tại các địa phương trong phạm vi cả nước trong giai đoạn 2016 - 2018.
- Gia súc (trâu, bò) được tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018 tại một số địa phương.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu
- Số liệu dịch bệnh LMLM chi tiết đến cấp xã do Chi cục Thú y/Chăn nuôi và Thú y các tỉnh, thành phố báo cáo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018.
- Kết quả xét nghiệm, xác định serotype và topotype LMLM do các Chi cục Thú y vùng tổng hợp và báo Cục Thú y từ năm 2016 - 2018.
- Dữ liệu địa lý và phần mềm vẽ bản đồ dịch tễ, phân tích thống kê R và các gói phân tích tương ứng như epiR (Stevenson, 2012a) và Spatstat (Baddeley and Turner, 2005).
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh LMLM ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018.
- Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử của vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam giai đoạn từ năm 2016 - 2018.
- Đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh trong năm 2018.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp dịch tễ học hồi cứu (retrospective cohort study) Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh Phương pháp phân tích theo đối tượng mắc bệnh
Tỷ lệ các loài gia súc (trâu, bò, lợn, dê, cừu) mắc bệnh trong tổng số gia súc mắc bệnh LMLM được tổng hợp cho mỗi tỉnh nghiên cứu. Tương tự, tỷ lệ các loài gia súc bị chết trong các ổ dịch bệnh LMLM.
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo thời gian
- Phương pháp xây dựng biểu đồ dịch tễ: tổng số ổ dịch (xã có gia súc mắc bệnh, chết vì LMLM) được đếm cho mỗi ngày xuất hiện ca bệnh đầu tiên của ổ dịch và thể hiện ở dạng biểu đồ dịch tễ.
- Tỷ số lây lan ước tính (Estimated Dissemination Ratio, EDR): là số ổ dịch bệnh LMLM đếm được cho một giai đoạn (ví dụ: 05 ngày tương ứng với khoảng thời gian ủ bệnh trung bình của bệnh LMLM) chia cho số ổ dịch đếm được trong một khoảng thời gian tương tự (05 ngày), nhưng liền kề trước đó. Ví dụ: số ổ dịch đếm được từ ngày 11-15/1/2016 (05 ngày) là 17, chia cho số ổ dịch đếm được trong khoảng thời gian tương tự, liền kề trước đó từ 06-10/1/2016 (05 ngày) là 3. Như vậy, chỉ số EDR = 17/3 > 1 cho thấy dịch có chiều hướng lây lan mạnh. Ngược lại nếu chỉ số EDR <1 cho thấy dịch có chiều hướng giảm dần. EDR = 1 cho thấy dịch ổn định (không tăng, không giảm).
Phương pháp phân tích dịch bệnh theo không gian
- Nguy cơ mới mắc (Incidence Risk): là số xã có dịch bệnh LMLM/tổng số xã có nguy cơ của mỗi tỉnh cho mỗi năm và cho cả giai đoạn 2016 - 2018.
- Tọa độ địa lý X và Y được ghi chép cho từng ổ dịch bệnh LMLM (xã có dịch bệnh LMLM). Do các ổ dịch bệnh LMLM thường xảy ra với số lượng lớn
và thường lặp đi, lặp lại nhiều lần tại các xã, bản đồ Kernel (Pfeiffer et al., 2008; Stevenson, 2012b; Nguyễn Văn Long và cs., 2012) được sử dụng để thể hiện dữ liệu dạng điểm thông qua chỉ số ước tính mật độ điểm dịch (còn gọi là ước tính mật độ Kernel).
Nguyên tắc ước tính mật độ Kernel là: (1) Các vùng dịch sẽ được chia thành nhiều ô vuông có kích thước bằng nhau (ví dụ kích thước của mỗi ô vuông là: 200 200m2) và một vùng xung quanh mỗi điểm dịch (còn được coi là vùng Kernel) mới được tạo ra; (2) sau đó, tất cả các điểm dịch (ví dụ là y1; y2;……; yn) sẽ được đếm cho mỗi ô vuông và cuối cùng là sẽ tính tổng số điểm dịch trong vùng Kernel đó. Ví dụ, nếu y' thể hiện một điểm nói chung, thì y1; y2;……; yn thể hiện các điểm dịch mà chúng ta quan sát được. Khi đó, mật độ điểm dịch cho mỗi vùng Kernel ( f y,h ) được ước tính tại mỗi điểm y theo Công thức 1.
i i i h y y nh h y f 1 ' 1 , Công thức 1 Trong đó:
K là ước tính mật độ Kernel đối xứng của mỗi điểm y.
h là bandwidth (hoặc là thông số smoothing) – là bán kính của mỗi vùng Kernel khoanh tròn xung quanh mỗi điểm dịch.
n là số điểm dịch trong mỗi vùng dịch.
Phân bố không gian được thể hiện bằng tỷ số nguy cơ các xã có dịch là số xã có dịch bệnh LMLM chia cho tổng số xã có nguy cơ trong phạm vi không gian được chuẩn hóa (mỗi km2). Trong mỗi giai đoạn dịch (mỗi năm dịch), tổng số xã có nguy cơ là tổng số xã hiện có của mỗi tỉnh, vì lý do bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm lây lan mạnh, trong khi việc kiểm dịch nghiêm ngặt của nước ta vẫn còn nhiều khó khăn, do đó khả năng dịch bệnh LMLM lây lan từ một xã có dịch sang các xã khác trong tỉnh là hoàn toàn có thể.
3.5.2. Phương pháp giải trình tự gien
Trên cơ sở phân tích, đánh giá tình hình dịch bệnh LMLM, hàng năm, Cục Thú y đã chỉ đạo các đơn vị thuộc Cục tổ chức lấy mẫu của gia súc từ các ổ dịch và từ các chương trình giám sát chủ động để chẩn đoán xét nghiệm, phân lập vi rút. Sau đó, lựa chọn các mẫu vi rút đại diện (về không gian, thời gian và đối tượng
động vật nhiễm vi rút) gửi đến phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright của Vương Quốc Anh để giải trình tự gien, xác định chủng vi rút và phân tích cây phả hệ.
Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE tại Pirbright đã giải trình tự gien vi rút LMLM với quy trình được tóm tắt như sau:
- Mẫu được tách chiết thu hoạch RNA/DNA.
- Thực hiện phản ứng PCR nhằm khuyếch đại đoạn gien chứa vùng VP1 với kích thước sản phẩm 1300 bp bằng cặp mồi đặc hiệu.
- Tinh sạch sản phẩm DNA bằng kít chuyên dụng.
- Đưa vào máy giải trình gien để bắt đầu chạy theo chương trình cài đặt của từng loại máy nhằm thu được kết quả trình tự cuối cùng.
- Kết quả là những chuỗi nucleotic, các trình tự nucleotic được xuất ra máy vi tính.
- Kết quả giải mã gien sẽ được so sánh để tìm mối liên hệ với các trình tự gien của các nhóm/dòng vi rút khác đã được công bố trên Ngân hàng gien (NCBI) để so sánh với các chủng trên thế giới hoặc so sánh các chủng trong nước đã có kết quả trước đó bằng phần mềm MEGA để thể hiện cây phả hệ sinh dòng.
3.5.3. Đánh giá mức độ tương đồng kháng nguyên giữa kháng nguyên của vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa vắc xin và kháng nguyên của vi rút thực địa
Trên cơ sở kết quả giải trình tự và phân tích gien các chủng vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn từ năm 2016 - 2018, Phòng thí nghiệm của OIE tại Pirbright của Vương Quốc Anh và Senasa của Argentina đã nghiên cứu đánh giá mức tương đồng kháng nguyên của vi rút vắc xin và vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam (vaccine matching) dựa trên giá trị r1- antigenic relationship. Đây là các loại vắc xin LMLM đã được OIE khuyến cáo và nhiều quốc gia sử dụng trong nhiều năm qua.
Theo khuyến cáo của Phòng thí nghiệm tham chiếu của OIE cho thấy, mức tương đồng kháng nguyên được đánh giá dựa trên giá trị r1, cụ thể như sau:
- r1 ≥ 0,3: tương đồng cao, nghĩa là có mối liên hệ mật thiết giữa chủng vi rút thực địa và chủng vi rút vắc xin hiện đang sử dụng tại Việt Nam. Hay nói cách khác là vắc xin có khả năng bảo hộ gia súc không bị nhiễm bởi chủng vi rút thực địa này.
- r1< 0,3: tương đồng thấp, nghĩa là chủng vi rút thực địa có sự khác biệt so với chủng vi rút vắc xin hiện đang sử dụng tại Việt Nam. Hay nói cách khác là vắc xin không có khả năng bảo hộ gia súc khi nhiễm chủng vi rút thực địa này.
3.5.4. Phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch sau tiêm phòng vắc xin LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh LMLM của trâu, bò tại một số tỉnh
Trên cơ sở phân tích dịch tễ học không gian, sự phân bố của các chủng vi rút LMLM và mức độ tương đồng kháng nguyên của vi rút vắc xin và vi rút lưu hành tại Việt Nam trong giai đoạn 2016 - 2018, lựa chọn một số địa phương thuộc vùng khống chế và vùng đệm theo định nghĩa trong Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020 để đánh giá đáp ứng miễn dịch của trâu, bò sau tiêm phòng vắc xin LMLM trong năm 2018.
3.5.3.1. Thời gian và tần suất lấy mẫu
Lấy 01 (một) lần duy nhất sau khi kết thúc tiêm phòng mũi tiêm cuối cùng từ 04 tuần trở lên kể từ ngày tiêm phòng.
3.5.3.2. Loại mẫu
Huyết thanh của trâu, bò đã được tiêm phòng vắc xin LMLM (loại vắc xin sử dụng tiêm cho gia súc được Bộ NN&PTNT, Bộ Tài chính mua cấp phát cho các địa phương hoặc hướng dẫn về kỹ thuật để cơ quan chuyên môn thú y của địa phương mua và sử dụng, bảo đảm thống nhất với Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM giai đoạn 2016 - 2020).
3.5.3.3. Số lượng mẫu
Tại mỗi huyện, lựa chọn ít nhất 03 xã và lấy 30 mẫu huyết thanh trâu (10 mẫu mỗi xã) và 30 mẫu huyết thanh bò (10 mẫu mỗi xã) sau khi tiêm vắc xin LMLM theo quy định để đánh giá tỷ lệ bảo hộ.
Trong trường hợp số lượng trâu không đủ để lấy mẫu thì có thể lấy mẫu trên bò và ngược lại.
3.5.3.4. Bảo quản và vận chuyển mẫu
Mẫu huyết thanh phải được bảo quản lạnh trong thùng bảo ôn (khoảng 4oC - 8oC) và vận chuyển đến phòng xét nghiệm trong vòng 48 giờ sau khi lấy mẫu.
3.5.3.5. Phương pháp xét nghiệm mẫu
Sử dụng phương pháp LPB-ELISA theo TCVN 8400-1:2010 (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2010) đánh giá kháng thể bảo hộ đối với vi rút LMLM type O
(nếu dùng vắc xin đơn giá) hoặc kháng thể bảo hộ đối với type O và type A (nếu dùng vắc xin nhị giá O&A); kháng nguyên sử dụng để xét nghiệm do Phòng thí nghiệm của OIE tại Pirbright cung cấp.
3.6. QUẢN LÝ VÀ PHÂN TÍCH SỐ LIỆU
Sử dụng phương pháp thống kê sinh học và các chương trình phân tích dịch tễ, thống kê như: ArcGIS 10.3, R và các bộ công cụ phân tích, BioEdit, MEGA để xử lý, phân tích số liệu, vẽ bản đồ dịch tễ, xây dựng cây phả hệ sinh dòng.
- Kết quả xét nghiệm và dữ liệu thu từ thực địa được nhập vào file MS. Excel 2010.
- Phân tích dịch tễ học mô tả (theo không gian, thời gian và theo đối tượng, sự phân bố của các chủng vi rút) theo các phương pháp dịch tễ, thống kê thường quy và các bộ công cụ phân tích dịch tễ (Stevenson, 2012a) trong phần mềm R.
- Tỷ lệ gia súc bị bệnh, gia súc chết do bệnh LMLM, nguy cơ có dịch, tỷ lệ dương tính với kháng thể của vắc xin được tính theo phương pháp của Fleiss (Fleiss, 1981).
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH LMLM Ở VIỆT NAM GIAI ĐOẠN TỪ NĂM 2016 - 2018 NAM GIAI ĐOẠN TỪ NĂM 2016 - 2018
4.1.1. Các loài gia súc mắc bệnh LMLM
Kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ theo loài gia súc mắc bệnh được thể hiện tại Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ gia súc mắc bệnh LMLM, giai đoạn từ năm 2016 - 2018
Năm
Tổng số mắc
(con)
Trâu Bò Lợn Dê, cừu
Số mắc (con) Tỷ lệ mắc (95% CI) Số mắc (con) Tỷ lệ mắc (95% CI) Số mắc (con) Tỷ lệ mắc (95% CI) Số mắc (con) Tỷ lệ mắc (95% CI) 2016 3.534 1.005 28,4 (27,0-29,9) 2.159 61,1 (59,5-62,7) 363 10,3 (9,3-11,3) 7 0,2 (0,1-0,3) 2017 7.135 522 7,3 (6,7-7,9) 5.399 75,7 (74,7-76,7) 1.209 16,9 (16,1-17,8) 5 0,1 (0,0-0,1) 2018 18.098 1.731 9,6 (9,1-10,0) 5.642 31,2 (30,5-31,8) 10.664 58,9 (58,2-59,6) 61 0,3 (0,3-0,4) Tổng cộng 28.767 3.258 11,3 (11,0-11,7) 13.200 45,9 (45,3-46,5) 12.236 42,5 (42,0-43,1) 73 0,3 (0,2-0,3)
Kết quả Bảng 4.1 cho thấy có sự khác biệt rõ ràng về số lượng và tỷ lệ các loài gia súc mắc bệnh LMLM trong giai đoạn từ năm 2016 - 2018, cụ thể: Bò có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất, chiếm 45,9% (95% CI 45,3 - 46,5); tiếp theo là lợn 42,5% (95% CI 42,0 - 43,1) và thấp nhất là dê, cừu với tỷ lệ mắc bệnh là 0,3% (95% CI 0,2 - 0,3). Theo chúng tôi, do bò là đối tượng chủ yếu được vận chuyển từ nước ngoài vào Việt Nam, bao gồm cả bò được nhập theo đường chính ngạch và bò được vận chuyển theo đường tiểu ngạch qua các cửa khẩu, lối mòn, lối mở tại các vùng biên giới giữa Việt Nam với Campuchia, Lào và Trung Quốc. Sau đó được vận chuyển đi các tỉnh thành để phục vụ nhu cầu tiêu dùng, do đó nguy cơ dịch bệnh xâm nhập và xảy ra tại Việt Nam là rất lớn; hoặc bò chưa được tiêm phòng hoặc đã được tiêm phòng nhưng không có khả năng bảo hộ trước các chủng vi rút LMLM lưu hành tại Việt Nam.
Tỷ lệ bò mắc bệnh trong cả giai đoạn 2016 - 2018 cao hơn nhiều so với tỷ lệ bò mắc bệnh trong giai đoạn 2006 - 2012 là 21,1% (Nguyễn Thu Thủy và cs., 2013),
đặc biệt năm 2017, bò mắc bệnh LMLM với tỷ lệ 75,7% (95% CI 74,7 - 76,7). Lý do có thể là các ổ dịch phát sinh chủ yếu là do gia súc không rõ nguồn gốc xuất xứ, được đưa từ vùng có ổ dịch cũ trong khi việc tiêm phòng vắc xin LMLM cho đàn gia súc trên địa bàn chưa đảm bảo (tiêm không đạt tỷ lệ, chỉ tiêm vắc xin từ nguồn hỗ trợ của Trung ương) tạo thuận lợi cho dịch bệnh phát sinh và lây lan.
Trong 03 năm nghiên cứu, trâu là loài mẫn cảm thấp, với tỷ lệ 11,3% (95% CI 11,0 - 11,7), cao nhất là năm 2016 với tỷ lệ mắc là 28,4% (95% CI 27,0 - 29,9) và thấp nhất là năm 2017 với tỷ lệ mắc 7,3% (95% CI 6,7 - 7,9). Kết quả này cũng thấp hơn so với tỷ lệ mắc trung bình của trâu trong giai đoạn 2006 - 2012 là 33,4% (Nguyễn Thu Thủy và cs., 2013).
Kết quả phân tích cũng cho thấy, trong giai đoạn nghiên cứu từ 2016 - 2018, lợn là loài mẫn cảm thứ hai đối với bệnh LMLM; trong đó, năm 2018, tỷ lệ lợn bị bệnh tăng mạnh, 58,9% (95% CI 58,2 - 59,6) so với 02 năm 2016 và 2017, tuy nhiên ghi nhận chủ yếu trên đàn lợn thịt và xảy ra ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ. Nguyên nhân có thể là do quá trình người dân mua bán, thương lái vận chuyển động vật, sản phẩm động vật bị nhiễm bệnh từ địa phương khác về để chăn nuôi và sử dụng, người dân đi chợ mua thức ăn từ phế phẩm của trâu bò, lợn về chăn nuôi đã làm lây lan bệnh LMLM trên đàn lợn của các hộ dân. Mặt khác, do môi trường nước thải chăn nuôi của người dân ở nông thôn chảy ra mương, rãnh, ao tù gây ô nhiễm môi trường, tiềm ẩn mầm dịch bệnh và theo dòng chảy phát tán dịch bệnh rất nhanh chóng.
Chúng tôi cũng đặt ra câu hỏi tại sao dịch LMLM xảy ra chủ yếu ở đàn lợn thịt? Lý do, trong Chương trình quốc gia phòng, chống bệnh LMLM của Trung ương và các địa phương, cũng như thực tế nhiều năm qua chỉ tập trung tiêm phòng cho đàn lợn nái và lợn giống; không tiêm phòng vắc xin LMLM cho đàn lợn thịt. Lợn thịt có số lượng tổng đàn lớn, chu kỳ sản xuất ngắn (2 - 4 tháng) trong khi một số loại vắc xin LMLM đòi hỏi phải tiêm 2 mũi cách nhau 28 ngày, nên chủ gia súc không tiêm phòng vắc xin cho lợn của họ. Mặt khác do sự biến đổi của chủng vi rút trong năm này nên bệnh LMLM không xảy ra nhiều ở trâu bò mà xảy ra chủ yếu với lợn (nội dung này được phân tích ở các phần tiếp theo).
Đặc biệt, theo dõi trong 03 năm 2016 - 2018 cho thấy: Dê, cừu ít mẫn cảm hơn cả, hầu như năm nào dịch LMLM cũng xảy ra ở các loài gia súc là trâu, bò, lợn nhưng số ổ dịch trên dê và cừu xảy ra rất ít, hầu như lẻ tẻ vài ổ dịch/năm.
Kết quả nghiên cứu đã phản ánh những nét đặc thù của dịch LMLM tại Việt