2.2.2.1. Nghiên cứu vi cấu trúc các mẫu xương: Mô tả hình ảnh và đánh giá
cấu trúc mẫu can xương, mẫu xương chứng, qua các tiêu bản thu được, trên kính hiển vi quang học, độ phóng đại 100- 400 lần, tại Khoa GPB- Bệnh viện Việt Đức và Khoa Hình thái- Viện 69, Bộ Tư lệnh lăng CT.HCM.
Các mảnh xương được cố định bằng formol 10%, qua 24 tiếng được khử bằng axit Nitoric, đúc nến và tạo các lát tiêu bản mỏng 5µm theo trục dọc và ngang miếng xương, được nhuộm bằng phương pháp ngấm bạc
(Reticuline). Hoặc các mẫu được chuẩn bị theo quy trình định sẵn của phương pháp nhuộm H.E, nhuộm Schmorl. Các tiêu bản được soi dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 đến 400 lần.
Các chỉ tiêu nghiên cứu.
- Đánh giá phản ứng viêm tại tổ chức xương và phần mềm xung quanh. + Có viêm:
a. nặng: Có tế bào viêm dày đặc hoặc tạo nang Lympho b. Nhẹ: Viêm rải rác
c. Trung bình: Giữa hai mức trên + Không viêm: không có tế bào viêm.
- Cấu trúc mô học của khối xương sau ghép:
+ Cấu trúc bình thường: Chất căn bản xương đồng nhất, ưa thuốc nhuộm acid, tạo các lá xương, bè xương, các sợi ossein vùi trong chất căn bản. Các tế bào xương là những tế bào nhiều nhánh, thân dài 20-30µm nằm trong các ổ xương, các nhánh nối với các nhánh của các tế bào bên cạnh. Nhân tế bào hình trứng, sẫm màu. Ngoài ra còn có tạo cốt bào, hủy cốt bào.
+ Cấu trúc bất thường: Có nhiều tổ chức xơ xen lẫn các bè xương, các tế bào có hình dạng và cấu trúc không giống như trên.
- Đánh giá mức độ xơ của tổ chức xương Nặng: Thành giải xơ, hyalin hóa
Nhẹ: Tăng sinh xơ sợi mảnh, rải rác có sợi xơ. Trung bình: Giữa hai mức độ trên
- So sánh cấu trúc của mẫu can xương và mẫu xương lành làm chứng trên cùng bệnh nhân về các tiêu chí: Số lượng tế bào, mật độ xương / vi trường, đường kính lòng ống havers và đường kính hệ thống havers toàn vẹn. Dùng phần mềm đo đếm Image Pro- Plus đi kèm kính hiển vi quang học Nikon:
Đếm số lượng tế bào trên mỗi vi trường: Đánh dấu và đếm số lượng tế bào trên mỗi vi trường, mỗi tiêu bản chúng tôi chọn ngẫu nhiên 10 vi trường khác nhau, lấy kết quả trung bình đã làm tròn.
Đo mật độ xương trên một vi trường: Đo diện tích các lá xương trên diện tích toàn bộ vi trường, tính ra tỉ lệ %; mỗi tiêu bản đo 10 vi trường lấy kết quả trung bình.
Đo đường kính lòng ống havers và đường kính hệ thống havers toàn vẹn của hai mẫu xương, mỗi mẫu xương đo 10 hệ thống havers, lấy kết quả trung bình của 16 bệnh nhân so sánh với nhau.
Hình 2.11. Phần mềm đo, đếm số lượng, kich thước Image Pro- Plus đi kèm kính hiển vi quang học của hãng Nikon nhật bản
* Nguồn: Tư liệu nghiên cứu của tác giả, bệnh phẩm M5.
2.2.2.2. Nghiên cứu siêu cấu trúc các mẫu xương: Mô tả hình ảnh và đánh giá
được, trên kính hiển vi điện tử quét và kính hiển vi điện tử truyền qua ở độ phóng đại 75-35.000 lần, tại Khoa Hình thái- Viện 69, Bộ Tư lệnh lăng CT.HCM.
- Nghiên cứu mẫu xương trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 của hãng JEOL Nhật Bản.
Sử dụng cưa chuyên dụng cưa xương thành các mẫu nhỏ có kích thước khoảng 0,5 x 0,5cm. Cố định mẫu trong glutaraldehyte 3% với thời gian 2 - 4giờ. Loại bỏ chất khoáng trong các mẫu xương (khử khoáng xương) bằng dung dịch ethylen diamin tetra acetic (EDTA) 5%, thời gian từ 15 đến 20 ngày. Đúc mẫu trong epon, để tủ ấm 370C trong 24 giờ; 600C trong 48 giờ. Cắt tiêu bản trên máy siêu cắt ultramicrotome LKB4, độ dầy lát cắt 50nm. Nhuộm tiêu bản siêu mỏng bằng uranyl acetate và chì citrate. Nghiên cứu tiêu bản trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400 của hãng JEOL Nhật Bản (xem thêm quy trình xử lý mẫu xương nghiên cứu trên kính hiển vi điện tử truyền qua- phụ lục 2).
- Nghiên cứu mẫu xương trên kính hiển vi điện tử quét + Pha khoáng( loại bỏ thành phần hữu cơ)
Cưa xương thành các mẫu nhỏ có kích thước 0,5cm x 0,5cm. Rửa mẫu dưới vòi nước ấm 3 – 5 phút để loại bỏ mạt cưa.
Khử chất hữu cơ xương bằng dung dịch natri hypoclorit 5% x 3 – 5 ngày. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy 24 giờ.
Khử nước trong các mẫu bằng cồn có nồng độ tăng dần theo qui trình. Khử cồn trong các mẫu xương bằng ether theo qui trình:
Cồn 1000+ ether nguyên chất (tỉ lệ 1/1) x 20phút/lần x1 lần. Ether nguyên chất x 20 phút/lần x 1 lần.
Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC-1200
Nghiên cứu mẫu dưới kính hiển vi điện tử quét JSM-5410LV. Xem bề mặt pha khoáng mô xương và pha khoáng mặt cắt mô xương
+ Pha hữu cơ ( loại bỏ khoáng).
Rửa mẫu dưới vòi nước ấm 3 – 5 phút để loại bỏ mạt cưa.
Ngâm các mẫu xương trong dung dịch tripsin 1,5% trong 5 – 7 ngày, hằng ngày thay dung dịch tripsin để loại bỏ màng xương tuỷ xương.
Khử chất khoáng mô xương bằng dung dịch axit nitric 5% x 5 – 7 ngày. Rửa mẫu dưới vòi nước chảy 24 giờ.
Khử nước trong các mẫu bằng cồn có nồng độ tăng dần theo qui trình. Khử cồn trong các mẫu xương bằng cồn T - Butyl theo qui trình:
Ngâm các mẫu xương trong cồn T – Butyl x 30 phút/lần x 3 lần. Sau lần 3 để trong ngăn đá tủ lạnh 30 phút đến 1h.
Bốc bay cồn T – Butyl trong máy JFD 100 trong 2- 5h. Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC-1200
Nghiên cứu mẫu dưới kính hiển vi điện tử quét JSM-5410LV. Xem cấu trúc mặt cắt mô xương.
Các chỉ tiêu nghiên cứu.
- Tìm và mô tả hình ảnh, cấu trúc mô xương : Cấu trúc havers đặc, xốp, hệ thống sợi collagen, cấu trúc các lá xương sáng và tối.
- Tìm các ổ tế bào với các vi quản xương, các mạch nuôi xương.
- Tìm và mô tả các tế bào xương nằm trong ổ xương với các nhánh bào tương nằm trong vi quản.
- Tìm được các hình ảnh các bào quan trong bào tương của các tế bào xương trên các mẫu tiêu bản: Lưới nội bào, bộ Golgi, ribosom...
- Dùng phần mềm đo Image Pro- Plus đi kèm để so sánh mẫu can xương và mẫu xương chứng với các tiêu chí :
+ Độ dày lá xương sáng và lá xương tối: Đo độ dày lá xương sáng và lá xương tối của hai mẫu xương, lấy kết quả trung bình của 16 bệnh nhân đem so với nhau.
+ Kích thước ngang sợi collagen: Đo kích thước ngang sợi collagen của hai mẫu xương, lấy kết quả trung bình của 16 bệnh nhân so sánh với nhau.
Hình 2.12. Cách đo kích thước các lá xương và đường kính ngang sợi collagen.
* Nguồn: Tư liệu nghiên cứu của tác giả.