- Nhiệt độ khí đầu vào: 200oC Tốc độ bơm nguyên liệu:
Chương IV BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
4.2. Nuôi trồng chủng tiềm năng PQ6 ở các hệ thống lên men
Khi nuôi trồng chủng PQ6 trong hệ thống lên men 5 và 10 lít với các thông số nuôi trồng được theo dõi chặt chẽ (nhiệt độ, chế độ sục khí, khuấy đảo …) đã cho thấy mặc dù hình thái tế bào có sự thay đổi tương đối giống nhau nhưng sinh trưởng và lipit có sự khác biệt rất rõ nét. Trong 24 giờ đầu, sinh trưởng của tảo trong bình 10 lít diễn ra mạnh hơn, mật độ tế bào tăng nhanh từ 1,9 x 106 tế bào/ml lên 30,1 x 106 tế bào/ml trong khi đó ở bình lên men 5 lít, mật độ chỉ tăng lên đến 14,05 x 106 tế bào/ml. Điều này cũng phản ánh rất rõ qua giá trị DO (dissolve oxygen- oxy hòa tan) trong môi trường đã ghi lại. Giá trị DO ở trong các bình này được giữ một cách tự nhiên. Ở bình 5 lít, giá trị DO giảm từ 100% xuống còn 7-8% trong 24 giờ đầu, trong khi đó ở bình 10 lít, giá trị DO giảm xuống chỉ còn 4,7%. Do trong quá trình sinh trưởng, tế bào cần một lượng lớn các chất trao đổi cơ bản như axít nucleic, các enzyme hay protein nên tốc độ tiêu thụ oxy ở pha này là rất lớn. Hàm lượng DO sau 24 giờ trở đi được duy trì ở giá trị rất thấp, chỉ dao động trong khoảng 3-4% ở cả hệ thống lên men 5 và 10 lít. Chính vì vậy, mật độ tế bào trong cả hai hệ thống lên men 5 và 10 lít thay đổi không nhiều và chỉ đạt cực đại ở 46,5 và 49,71 x 106 tế bào/ml, tương ứng. Glucose được sử dụng chủ yếu cho sinh trưởng. Mật độ tế bào tăng từ từ đến giá trị cực đại vào thời điểm 96 giờ. Tại thời điểm này hàm lượng glucose còn lại trong hệ thống lên men 5 lít là khá lớn (24,04 mg/ml) trong khi đó ở bình lên men 10 lít chỉ còn là 5,01 mg/ml. Lượng sinh khối khô và hàm lượng lipit trong hai bình lên men 5 và 10 lít tương ứng là 23,70 g/l và 38,56% KLK; 25,34 g/l và 46,23 % KLK.
Chi và cộng sự (2009) khi nghiên cứu về quy trình lên men S. limacinum
SR21 theo kiểu hai pha đã thấy rằng kiểm soát được giá trị DO sẽ giúp đạt hiệu quả cao về sinh khối và sản lượng DHA. Trong pha sinh trưởng, nếu DO bão hòa được
giữ ở mức 50% thì mật độ tế bào đạt 181 x 106 tế bào/ml, trong khi đó, nếu duy trì ở mức 10% DO thì mật độ chỉ đạt 98,4 x 106 tế bào/ml, và ở điều kiện nuôi lắc trong bình tam giác với tốc độ lắc cố định 150 rpm thì mật độ chỉ đạt 22,5 x 106 tế bào/ml. Khi giá trị DO tăng sẽ dẫn đến việc giảm pH và giảm sự tích lũy lipit, ngược lại khi nồng độ oxy giảm lại làm tăng sự tích lũy lipit. Vì vậy, một quy trình nuôi cấy hai pha đã được đưa ra trong đó pha đầu tập trung vào việc nâng cao mật độ tế bào nhưng không tăng về mặt kích cỡ và khối lượng của từng tế bào. Pha hai tập trung vào việc tăng kích thước tế bào. Khi đó tế bào ngừng phân chia nhưng kích thước tế bào trở nên lớn hơn do có sự tích lũy cao lipit. Bailey và cộng sự (2003) cũng đạt được kết quả tương tự như trên mặc dù hàm lượng DO yêu cầu được giữ trong quy trình lên men ít nhất là 4%. Khi DO được duy trì ở mức 40%, hàm lượng FAME (fatty acid methyl ester) trong sinh khối chỉ đạt 18,2% nhưng nếu giảm xuống 5% thì hàm lượng FAME đạt được là 24,4%. Như vậy, các kết quả nghiên cứu thu được nêu trên đều cho thấy ở Schizochytrium hàm lượng oxy thấp thích hợp hơn cho việc sản xuất lipit cũng như PUFA. Ảnh hưởng của hàm lượng DO tới quá trình khử bão hòa các axít béo cũng đang là vấn đề khoa học gây tranh cãi bởi theo Bailey và cộng sự (2003) khi hàm lượng cao DO sẽ làm giảm tỷ lệ DHA/FAME từ 40% (ở 5% DO) xuống còn 30,6% (ở 40% DO). Ngược lại, tác giả Roux và cộng sự (1995) lại ghi nhận thấy hàm lượng của axit gamma-linolenic ở sinh khối Mucor circinelloides đã tăng lên từ 4,6% (ở 5% DO) đến 12,4% (ở 35% DO).
Bằng quy trình nuôi cấy hai pha như trên, Chi và cộng sự (2009) đã thu được 37,9 g/l sinh khối và 6,56 g/l DHA sau 40 giờ nuôi cấy. Khi so sánh với kết quả thu được trong lên men chủng PQ6 đã cho thấy sản lượng DHA đạt được sau 96 giờ nuôi cấy ở bình lên men 5 và 10 lít tương ứng là 8,71 và 11,55 g/l mặc dù cao hơn nhưng thời gian nuôi của chủng PQ6 lại kéo dài hơn 2,4 lần. Tuy nhiên, trong trường hợp của chủng PQ6 đó là quy trình lên men theo mẻ, hàm lượng DO không được kiểm soát nhưng để chúng diễn biến theo chiều hướng tự nhiên. Hàm lượng 50% DO trong môi trường nuôi ở bình lên men 5 và 10 lít chỉ đạt được ở giai đoạn 0 đến 12 giờ đầu tiên. Sau 12 giờ, giá trị DO ở mức thấp do lúc này sinh trưởng của
tế bào diễn ra mạnh mẽ mà tốc độ sục khí lại duy trì ở mức không đổi. Do đó, giá trị DO ở mức chỉ thích hợp cho việc tích lũy lipit trong tế bào. Jakobsen và cộng sự (2008) khi nghiên cứu quá trình lên men theo mẻ chủng Aurantiochytrium sp. T66 cũng đã khẳng định ngoài sự thiếu hụt N và P thì sự giới hạn về hàm lượng oxy cũng là một trong những yếu tố nhằm nâng cao sự tích luỹ lipit (hàm lượng lipit có thể đến 54-63% khối lượng khô) bởi sự thiếu oxy sẽ gây ức chế hoạt động các enzyme desaturase phụ thuộc oxy nhưng lại là điều kiện thích hợp cho các enzyme tổng hợp PUFA không phụ thuộc vào oxy hoạt động tốt. Cũng tương tự, Chi và cộng sự (2009) đã nhận thấy sục khí sẽ không có lợi lên sự tích lũy các axit béo ở A.
limacinum SR21.
Quá trình lên men theo mẻ được Hong và cộng sự (2011) nghiên cứu trên chủng Aurantiochytrium sp. KRS101 trong bình lên men 5 lít chứa 2 lít môi trường có thành phần 60 g/l glucose, cao ngô (corn steep solid) 5 g/l, CH3COONa 3 g/l, KH2PO4 3 g/l và muối biển nhân tạo 6 g/l. Có thể thấy môi trường sử dụng để nuôi trồng Aurantiochytrium sp. KRS101 là rất khác với môi trường lên men của chủng PQ6. Glucose và CH3COONa được sử dụng như nguồn C, trong khi đó cao ngô được sử dụng như nguồn nitơ thay vì cao nấm nen, ngoài ra, một lượng KH2PO4 được cung cấp vào môi trường nuôi cấy như một nguồn P. Lượng muối biển nhân tạo được sử dụng ở mức thấp là 6 g/l. Các điều kiện nuôi cấy khác được duy trì bao gồm 28oC, tốc độ khuấy 200 rpm, thổi khí liên tục 1 lít/lít/phút, pH=7,0. Lượng glucose được tiêu thu hoàn toàn vào thời điểm 72 giờ, lượng sinh khối đạt 24,8 g SKK/l, sản lượng DHA là 2,84 g/l. So với chủng PQ6 nuôi trong bình lên men 5 lít thì lượng SKK khô đạt gần tương đương trong khi sản lượng DHA của chủng PQ6 đạt được cao hơn đáng kể (8,71 g/l).
Khi nâng thể tích lên men lên 15 lít (bình 30 lít tự tạo), MĐTB chủng PQ6 trong 24 giờ đầu tăng rất nhanh từ 2,56 x 106 tế bào/ml lên 78,12 x 106 tế bào/ml và tiếp tục tăng cho đến 130,14 x 106 tế bào/ml ở thời điểm 96 giờ, sau đó mật độ tế bào hầu như không thay đổi cho đến 168 giờ. Do là bình lên men tự tạo nên các hệ thống điều chỉnh tự động về nhiệt độ, khuấy sục hoặc các hệ thống đo các thông số
của môi trường lên men là không có. Vì vậy, việc lên men hoàn toàn được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ phòng cũng như các chế độ khuấy được cố định (350-400 rpm), khí được lọc qua cột lọc và màng lọc vô trùng sau đó sục liên tục vào bình lên men. Mặc dù lượng sinh khối khô, mật độ tế bào đạt được có cao hơn so với bình lên men 5 và 10 lít (dao động từ 29,87-30,05 g/l) nhưng thời gian sinh trưởng đi vào pha cân bằng là chậm hơn (120 giờ). Hàm lượng DHA so với % axit béo tổng số thấp hơn rất nhiều so với bình lên men 5 và 10 lít dẫn đến sản lượng DHA trên một đơn vị thể tích là thấp hơn (sản lượng DHA vào thời điểm 96 giờ chỉ đạt khoảng 2,49 g/l). Ngoài ra, ở các bình lên men 30 lít tự tạo, chúng tôi đã thay thế cao nấm men ngoại (đắt tiền- giá 3-4 triệu đồng/kg) thành cao nấm men nội do Viện Công nghiệp thực phẩm sản xuất (có giá 600 nghìn đồng/kg) nhằm giảm giá thành sinh khối tảo nuôi được. Vì cao nấm men nội nên có thể chất lượng không tốt như cao nấm men ngoại nên đây có thể là một trong những nguyên nhân làm cho sản lượng DHA đạt được thấp hơn khi nuôi ở bình 5, và 10 lít.
Để nâng cao hàm lượng DHA trong bình lên men 30 lít chúng tôi đã thử nghiệm việc bảo quản dịch nuôi ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy nhiệt độ là một trong những nhân tố môi trường rất quan trọng ảnh hưởng đến sinh trưởng của tảo và việc tổng hợp các thành phần tế bào như lipít, axít béo và carotenoit thứ cấp... Jiang & Chen (2000) thông báo rằng, loài
Crypthecodinium cohnii khi được nuôi trồng dị dưỡng ở 15oC mặc dù có tốc độ sinh
trưởng đặc trưng thấp hơn nhưng hàm lượng DHA cao hơn ở 30oC. Nhiệt độ thấp cũng dẫn đến hàm lượng các PUFA cao ở Nitzschia laevis và loài C. cohnii. Hàm lượng PUFA cao khi nuôi trồng tảo ở nhiệt độ thấp có thể được giải thích là do tảo cần tạo nhiều PUFA để duy trì trạng thái lỏng thích hợp nhất của màng tế bào. Một lý do khác có thể xẩy ra là do nhiệt độ thấp sẽ dẫn đến hàm lượng oxy phân tử trong nội bào cao và do đó, hoạt tính của enzyme desaturase và elongase – 2 enzyme tham gia trong quá trình tổng hợp PUFA ở các loài vi tảo này được tăng lên (Jiang & Chen, 2000).
Jain và cs (2004) cũng đã sớm chỉ ra rằng hàm lượng DHA tăng khi tế bào thraustochytrid được giữ lạnh hoặc khi bổ sung PVP (polyvinyl pyrrolidone) vào môi trường nuôi cấy. Chúng tôi đã tiến hành thu dịch lên men ở bình 30 lít tại các thời điểm khác nhau và thử nghiệm bảo quản ở hai chế độ nhiệt độ khác nhau là 10oC và nhiệt độ phòng trong 48 giờ, sau khi thu hoạch dịch nuôi vào thời điểm 120 giờ và 168 giờ. Các kết quả thu được cho thấy việc bảo quản ở nhiệt độ thấp không làm tăng hàm lượng lipit cũng như DHA ở chủng PQ6. Điều này có thể do S.
mangrovei PQ6 không sử dụng con đường FAS (fatty acid synthase) trong đó có sự
tham gia của các enzyme desaturase và elongase để tổng hợp PUFA mà thay vào đó chúng sử dụng con đường PKS (polyketide synthase). Có thể vì lẽ đó mà nhiệt độ thấp đã không làm tăng hoạt tính của hai loại enzyme này.
Hàm lượng DHA và lipit tổng số khi nuôi chủng PQ6 trong bình lên men 30 lít chỉ tăng khi kéo dài thời gian nuôi cấy lên 168 giờ. Tuy nhiên, nếu tiếp tục để dịch nuôi tĩnh ở nhiệt độ phòng, sẽ làm giảm đáng kể hàm lượng lipit (từ 55,60 xuống 35,30 % KLK). Do sản lượng DHA của bình lên men 30 lít còn khá thấp nên việc tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng các phương pháp lên men mới là rất cần thiết trong thời gian tới.
Trong một công bố gần đây của Huang và cộng sự (2012) khi nghiên cứu về cách thức lên men đối với Aurantiochytrium limacinum SR21 (tên cũ là S.
limacinum SR21) để nâng cao tỷ lệ phần trăm của DHA trong axit béo tổng số
nhằm đạt được sản lượng DHA cao đã cho rằng việc nuôi trồng theo kiểu hai pha có một số điểm không thuận lợi như thời gian nuôi kéo dài, kỹ thuật khó, không thuận tiện khi áp dụng với kiểu lên men liên tục. Do vậy, Huang và cộng sự (2012) đã sử dụng phương pháp cung cấp oxy không liên tục để duy trì DO ở mức 50% nhằm kích thích tế bào sinh trưởng cũng như tích luỹ lipit. Kết quả là ở tỷ lệ C/N bằng 1,25, trong môi trường có 100 g/l glycerol, 40 g/l cao nấm men và 40 g/l pepton, A.
limacinum SR21 đã đạt được 62,76 g SKK/l, lipit đạt 65,2%, lượng DHA đạt 20,3
g/l và sản lượng DHA là 122,62 mg/l/giờ. Trong thành phần axit béo, hàm lượng của C16:0 đã giảm xuống chỉ còn dưới 6% so với axit béo tổng số, ngược lại hàm
lượng DHA lại tăng lên đến 70% so với axit béo tổng số. Các kết quả thu được đã cho thấy trong điều kiện nguồn nitơ cũng như oxi là giới hạn thì việc nuôi cấy 2 pha là không cần thiết cho mục đích sản xuất DHA.
Ngoài phương pháp nuôi trồng theo mẻ, rất nhiều các phương pháp khác đã được nghiên cứu nhằm tăng cường việc sản xuất dầu ở các vi sinh vật trong đó phương pháp “fed batch” đã thể hiện rất hiệu quả trong việc tăng mật độ tế bào và hàm lượng lipit (Tang và cs, 2012; Zhang và cs, 2011). Hong và cộng sự (2011) đã áp dụng phương pháp này để nuôi Aurantiochytrium sp. KRS101. Khi đó, glucose được bổ sung vào bình lên men nhằm duy trì nồng độ đường nằm giữa 30 và 60 g/l. Kết quả thu được cho thấy sinh khối đạt cao nhất (50,2 g/l), lượng lipit tích luỹ tăng từ 31,2% (lên men theo mẻ) lên 43,5% khối lượng khô và DHA đạt 8,8 g/l (chiếm 40% so với axít béo tổng số) ở thời điểm 63,5 giờ.
Kim và cộng sự (2013) đã phát triển phương pháp nuôi trồng theo kiểu “fed batch” mới đối với Aurantiochytrium sp. KRS101. Từ những nghiên cứu về ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như dinh dưỡng và nồng độ muối lên sự tích luỹ lipit, DHA và C16:0 (axit palmitic) và hình thái tế bào cùng với việc phân tích nhu cầu dinh dưỡng đặc trưng của từng pha phát triển, xác định mối liên quan giữa nguồn C và N từ đó thiết kế phương pháp lên men “fed batch” theo kiểu mới để nuôi trồng Aurantiochytrium sp. KRS101. Do nhu cầu dinh dưỡng của vi tảo khác biệt trong từng pha sinh trưởng trong đó nitơ cần thiết trong pha đầu - khi mà tế bào sinh trưởng hoặc phân chia, trong khi đó, cacbon lại cần thiết cho quá trình hoàn chỉnh của tế bào trong pha phát triển, đặc biệt là sự lớn lên của tế bào ở giai đoạn sau nên các kiểu bổ sung C và N đã được thực hiện. Kết quả là dẫn đến sự tăng C16:0 (PA), DHA lên 137% và 29%, tương ứng.
Nuôi cấy liên tục thường cho sản lượng sinh khối và sản lượng sản phẩm cuối cùng cao. Ethier và cộng sự (2011) khi thử nghiệm nuôi cấy liên tục S.
limacium SR21 trên nguồn C là glycerol thô từ quá trình sản xuất biodiesel cũng đã
thu được lượng sinh khối tảo cao hơn so với kiểu nuôi cấy theo mẻ và “fed-batch”. Tuy nhiên, sản lượng DHA đạt được không cao hơn và thậm chí còn thấp hơn khi
so sánh với nuôi trồng kiểu “fed batch”. Đó là do hàm lượng DHA đạt được thấp khi nuôi cấy liên tục bởi có thể quy trình xử lý glycerol thô vẫn chưa loại hết xà phòng nên đã ức chế sự tổng hợp DHA. Ethier và cộng sự (2011) lại cho rằng nuôi cấy liên tục là một cách tiếp cận tốt nhất trong nghiên cứu thành phần axít béo trong sinh khối tảo. Quy trình nuôi cấy theo mẻ, các axít béo đặc biệt là PUFA tương quan chặt với tuổi tế bào. Axít béo tích luỹ ở pha cân bằng trong nuôi cấy theo mẻ, và giảm mạnh khi tế bào chuyển từ pha cân bằng sang pha tàn lụi. Vì vậy, rất khó để xác định chính xác thời gian thu hoạch tối ưu để hàm lượng axít béo đạt cao nhất. So với nuôi cấy theo mẻ và fed-batch, nuôi cấy liên tục cho thành phần axít béo ổn định khi các điều kiện như tốc độ pha loãng và bổ sung cơ chất được cố định (Ethier và cs, 2011).
Giá thành của dầu DHA từ Crypthecodinium cohnii và Schizochytrium vào khoảng 61,5 đôla/g (49 euro/g) (Brennan và Owende, 2010). Điều này cho thấy với giá thành cao như vậy cần sử dụng các cơ chất có chất lượng cao như glucose và cao nấm men để nuôi cấy các loài vi tảo nêu trên. Trên thị trường thế giới, glucose