- Máy xét nghiệm các thông số máu tự động SN195, Nhật Bản; máy cắt lát mô bệnh học Microtome Sartorius Werke (Đức); máy đo điện tâm đồ Cardisuny 501b35H
B. giếng 1-4: Plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen 18S rRNA của chủng PQ6, PQ7, TH16 và TB17 được cắt bằng enzyme EcoR I; giếng M: Thang chuẩn 1Kb Plus
3.2.1. Sinh trưởng chủng PQ6 trong bình lên men 5 và 10 lít
Chủng PQ6 được nuôi trồng trong hệ thống lên men BioFlo-110 fermentor/ Bioreactor 5 lít (Mỹ) với nhiệt độ môi trường nuôi được giữ ổn định ở 28oC, chế độ sục khí được duy trì ở mức 0,5 lít/lít môi trường/phút, chế độ khuấy được điều
khiển tăng dần theo thời gian nuôi cấy từ 200-400 vòng/phút. Sự thay đổi về mật độ tế bào (MĐTB), hàm lượng glucose còn dư trong môi trường và giá trị pH ở các thời điểm nuôi cấy được trình bày trên hình 3.13.
Giá trị pH ban đầu của môi trường nuôi nằm trong khoảng tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng PQ6 (6,0-7,0). Trong quá trình lên men, pH có sự tăng tuyến tính theo thời gian và đạt giá trị là 8,05 tại thời điểm 120 giờ. Trong 24 giờ đầu, MĐTB tăng chậm, sau đó tăng nhanh và rồi đi vào pha cân bằng. Sau 96 giờ nuôi cấy, tảo bắt đầu đi vào pha cân bằng với MĐTB đạt 46,0± 2,6 x 106 tế bào/ml, tương ứng với 23,7± 0,8 g khô/l. Hàm lượng glucose trong môi trường nuôi giảm dần cùng với sự tăng lên về sinh khối tảo. Đến thời điểm 120 giờ, hàm lượng glucose còn lại trong môi trường là 20,4 ± 3,12 mg/ml.
Cùng với sự thay đổi về MĐTB, hình dạng tế bào cũng có sự thay đổi rõ rệt trong vòng 24 giờ đầu lên men. Đây được xem là giai đoạn thích nghi của tế bào tảo với điều kiện nuôi. Trong 12 giờ đầu, tế bào “mỏng”, chưa có hình tròn đặc trưng. Tuy nhiên, sau 24 giờ, hình dạng tế bào trở nên ổn định, tròn, nội chất rõ ràng và màu sắc đậm hơn (Hình 3.15).
Hệ thống bình lên men 10 lít sử dụng là tương tự với hệ thống 5 lít đã đề cập ở phần trên. Điều kiện nuôi trồng chủng PQ6 trong hệ thống này cũng được duy trì tương tự như ở bình lên men 5 lít.
Kết quả chỉ ra trên hình 3.14 cho thấy, giá trị pH của môi trường tăng dần theo thời gian và đạt giá trị 8,12 tại thời điểm quá trình lên men kết thúc (120 giờ). MĐTB tăng nhanh trong vòng 24 giờ (từ 1,9 x 106 tế bào/ml lên 30,10 x 106 tế bào/ml) và sau 48 giờ trở đi MĐTB thay đổi không đáng kể (42,24 x 106 tế bào/ml – 49,25 x 106 tế bào/ml). Cũng tương tự như khi nuôi ở hệ thống bình 5 lít, thời điểm 96 giờ được coi là giai đoạn đầu của pha cân bằng. Lúc này lượng sinh khối khô của tảo đạt 25,34 ± 0,56 g/l, tương ứng với MĐTB là 49,71 x 106 tế bào/ml. Nồng độ glucose giảm rõ rệt trong từng thời điểm nuôi cấy. Tại thời điểm 120 giờ, hàm lượng đường còn lại trong môi trường là 2,12 mg/ml. So với hệ thống lên men 5 lít, glucose được sử dụng triệt để hơn cho sinh trưởng và tích luỹ lipit.
Hình thái tế bào sau 24 giờ lên men cũng trở nên rõ ràng hơn, tế bào tròn đều, màu sắc đậm dần, nội chất bắt đầu chiếm đầy không gian bên trong của tế bào.
Hình 3.14. Sinh trưởng của chủng PQ6, sự thay đổi pH và hàm lượng glucose còn dư trong môi trường nuôi trong bình lên men 10 lít
Sự thay đổi về hình thái tế bào chủng PQ6 trong quá trình nuôi cấy được chỉ ra ở hình 3.15.
Như vậy, khi thể tích lên men được tăng từ 5 lên 10 lít, sinh trưởng của chủng PQ6 không có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, hàm lượng lipit và sản lượng DHA tăng lên đáng kể (tương ứng tăng từ 38,56-46,23% KLK; 8,71-11,55 g/l) (Bảng 3.6). Tuy nhiên, khi nuôi cấy để thu một lượng lớn sinh khối để tiến hành các thí nghiệm ứng dụng sau này gặp phải nhiều khó khăn do giá thành vận hành hệ thống bình lên men 10 lít khá đắt. Do vậy, để có thể chủ động trong việc nuôi trồng tảo và giảm chi phí sản xuất sinh khối tảo, chủng PQ6 được nuôi trồng trong bình lên men 30 lít tự thiết kế sử dụng cao nấm men công nghiệp do Việt Nam sản xuất.
Bảng 3.6. Lượng sinh khối khô, hàm lượng lipit và DHA trong sinh khối chủng PQ6 nuôi ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít ở thời điểm 96 giờ
Hệ thống lên men (l)
Sinh khối khô (g/l)
Lipit tổng số (% KLK)
Hàm lượng DHA (% so với axít béo tổng
số)
Sản lượng DHA (g/l)
5 23,70 ± 0,85 38,56 ±1,78 57,36 8,71
10 25,34 ± 0,56 46,23 ±1,68 59,35 11,55
Ghi chú: “KLK”: khối lượng khô
A
B
Hình 3.15. Hình thái tế bào chủngPQ6 trong bình lên men 5 lít (A), 10 lít (B) ở các giai đoạn nuôi cấy khác nhau
Như vậy, khi nuôi trồng ở bình lên men 5 và 10 lít, thời gian thu hoạch tảo phù hợp là 96 giờ. Hàm lượng sinh khối khô và lipit tổng số đạt tương ứng là 23,70 ± 0,85 và 25,34 ± 0,56 g/l; 38,56 ±1,78 và 46,23 ±1,68% KLK. Sản lượng DHA đạt 8,71 g/l (bình 5 lít) và 11,55 g/l (bình 10 lít).