Con đường sinh tổng hợp DHA ở chi Schizochytrium

Con đường sinh tổng hợp DHA ở họ Thraustochytriidae hiện đang tập trung nhiều sự chú ý của các nhà nghiên cứu nhằm tạo ra thực vật hoặc nấm men tái tổ hợp có thể sản xuất ra PUFA (Wallis và cs, 2002; Damude & Kinney, 2007). Cho đến nay, có hai con đường tổng hợp PUFA ở họ Thraustochytriidae đã được nghiên cứu. Một là ở Thraustochytrium sp. ATCC 26185 theo con đường sinh tổng hợp axít béo điển hình gần giống với động vật có vú (FAS-fatty acid synthesis). Đây là con đường hiếu khí bao gồm một loạt các bước kéo dài chuỗi và khử bão hòa luân phiên nhau của chuỗi axít béo mạch ngắn. Các thực vật sản xuất axít linoleic (18:2-6) và axít linolenic (18:3-3) sử dụng hoạt tính của enzyme Δ12 và -3 desaturase (hình 1.4). Động vật có vú thiếu hoạt tính của enzyme Δ12 và -3 desaturase do vậy chúng phải lấy 18:2-6 và 18:3-3 từ thức ăn. Các axít béo khác tiếp tục được tổng hợp nhờ hàng loạt các phản ứng khử bão hòa và kéo dài chuỗi từ axít linoleic và linolenic diễn ra trong mạng lưới nội chất. Tổng hợp 22:6-3 ngày nay được biết bắt đầu từ sinh tổng hợp 24:6-3 ở mạng lưới nội chất sau đó, quá trình cắt ngắn chuỗi sẽ được thực hiện ở chu trình β-oxi hóa trong peroxisome. Con đường này đòi hỏi phải có oxy phân tử cho quá trình khử bão hòa (hình 1.4). Mặc dù cả động vật có vú và chi Thraustochytrium đều sử dụng con đường hiếu khí để tổng hợp DHA nhưng phần cuối của con đường đã được chia thành hai nhánh. Ở động vật có vú, tổng hợp DHA xảy ra sau quá trình tổng hợp EPA là quá trình chuyển hoá ngược độc lập với việc khử bão hoà 4. Trong khi đó, ở chi

Thraustochytrium, tổng hợp DHA sau EPA diễn ra theo một con đường đơn giản

hơn- quá trình khử bão hoà 4. Gen 4 desaturase từ Thraustochytrium sp. đã được tách dòng trong nấm men Saccharomyces cerevisiae và thực vật đột biến, Brassica

juncea (Qiu và cs, 2001).

Cho đến gần đây, con đường sinh tổng hợp DHA được xúc tác bởi enzyme polyketide synthase ở chi Schizochytrium mới được tìm thấy. Con đường này khác với con đường FAS ở chỗ nó không đòi hỏi quá trình khử bão hoà hiếu khí để đưa các liên kết đôi vào chuỗi acyl. Thay vào đó, các liên kết đôi được chèn vào trong

quá trình tổng hợp axít béo. Vì vậy, nó cũng được gọi là con đường tổng hợp DHA kị khí. Tuy nhiên, cũng cần lưu ý rằng mặc dù con đường này là kị khí nhưng nó cũng có thể xảy ra dưới điều kiện hiếu khí. Tên gọi này bắt nguồn từ việc không cần oxy phân tử tham gia trong các phản ứng theo con đường này (Qui, 2003). Polyketide là tên chỉ một nhóm các chất trao đổi thứ cấp được xây dựng nên từ rất nhiều nhóm ketide (–CH2–CO–). Chúng được tổng hợp bởi enzyme polyketide synthase (PKS) - một hệ thống enzyme tương tự như các fatty acid synthase ở vi khuẩn. Giống với sự tổng hợp các axít béo, chúng sử dụng các protein mang nhóm acyl- ACP ( acyl carrier protein) như là một vật gắn đồng hoá trị để tổng hợp chuỗi, và cứ như thế các chu trình được lặp lại. Một chu trình sinh tổng hợp hoàn chỉnh bao gồm bước trùng ngưng của một acyl- ACP và một malonyl- ACP để tạo ra một ketoacyl-ACP; bước khử keto để chuyển ketoacyl-ACP thành hydroxyacyl-ACP; khử nước để loại một phân tử nước ở hydroxyacyl-ACP để tạo thành enoyl-ACP không bão hoà, và quá trình khử enoyl-ACP thành chuỗi acyl bão hoà (hình 1.4). Tuy nhiên, không giống như con đường FAS, con đường tổng hợp polyketide thường bỏ qua các bước như là loại nước và khử. Vì vậy, mà các sản phẩm của con đường này thường rất khác nhau về cấu trúc và thường chứa nhóm keto, nhóm OH và các liên kết đôi. Con đường polyketide thường rất phổ biến trong tự nhiên. Ở vi khuẩn và nấm, nó tham gia vào quá trình tổng hợp rất nhiều các hợp chất kháng sinh và kháng kí sinh trùng như tetracycline và erythromycin. Gần đây, sự tham gia của con đường này vào quá trình sinh tổng hợp PUFA như DHA cũng đã được công bố. Các bằng chứng bao gồm: (1) Việc phân tích trình tự gen của Shewanella sp. và cơ sở dữ liệu EST (expressed sequence tags) của chi Schizochytrium đã cho thấy các khung đọc mở liên quan đến polyketide synthase hơn là fatty acid synthase; (2) Sự biểu hiện phần lớn trình tự hệ gen của Shewanella sp. ở E. coli dưới các điều kiện hiếu khí đã dẫn đến sản xuất được EPA trong các tế bào chuyển gen; (3) Việc đánh dấu không thành công in vivo với [1-14C] acetate đã chứng minh sự có mặt rất ít các axít béo trung gian C18, 20 và 22. Những chất này thường cho thấy mối quan hệ giữa tiền chất- sản phẩm trong con đường khử bão hoà/ kéo dài chuỗi; (4) 8500

trình tự EST của chi Schizochytrium không đủ để chứng minh con số mà người ta mong đợi về các loại enzyme desaturase khác nhau tham gia trong con đường hiếu khí, trong khi đó các trình tự tương đồng polyketide synthase lại được thể hiện rất rõ.

Hình 1.4. Con đường tổng hợp PUFA ở động vật có vú, thực vật và chi

Schizochytrium(Wallis và cs, 2002; Qui, 2003)

Chú thích: ACP: Protein mang gốc acyl; KS: 3-ketoacyl-ACP synthase; KR: 3- hydroxyacyl-ACP reductase; D/I: dehydrase/isomerase; ER: enoyl-ACP reductase

Mặc dù, cơ chế cụ thể về quá trình sinh tổng hợp DHA theo con đường mới vẫn cần phải xác định cho rõ ràng, nhưng cơ bản vẫn là các bước ngưng tụ và đồng phân hoá. Ketosynthase, một enzyme chìa khoá của con đường này, có thể xúc tác cho quá trình trùng ngưng của rất nhiều cơ chất bao gồm các axít béo không bão hoà. Vì vậy, trùng ngưng có chọn lọc của enoyl -ACP với malonyl -ACP sẽ tạo

z Thực vật 18:0 18:19 18:26 3 18:36 12 9 6 elo elo elo 6 24:63 18:43 20:43 20:53 22:53 24:53 24:63 22:63 22:63DHA -ox 18:36 20:36 20:46 AA Động vật có vú 6 elo 5 5 18:26 18:33 KS KR D/I ER Acyl-ACP Malonyl-ACP NADPH NADP+ Enoyl-ACP 3-Hydroxyacyl-ACP NADP+ NADPH H2O CO2 ACP-SH 3-Ketoacyl-ACP KS CO2 ACP-SH Schizochytrium

thành một axít béo có các liên kết đôi. Hoạt động của isomerase, một yếu tố chìa khoá khác cho sinh tổng hợp DHA, có thể kết hợp hoặc tách riêng với dehydratase để đảm bảo vị trí và cấu hình không gian chính xác các liên kết đôi trong phân tử PUFA (Qui, 2003).

1.4. Công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dưỡng nói chung và chi Schizochytrium

nói riêng cho sản xuất -3 PUFA