- Máy xét nghiệm các thông số máu tự động SN195, Nhật Bản; máy cắt lát mô bệnh học Microtome Sartorius Werke (Đức); máy đo điện tâm đồ Cardisuny 501b35H
2.5.3. Các phương pháp sinh học phân tử
Hầu hết các kĩ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001).
2.5.3.1. Tách chiết DNA tổng số từ các chủng Schizochytrium spp.
Các chủng Schizochytrium spp. được nuôi cấy riêng rẽ trong bình tam giác 100 ml chứa 50 ml môi trường M1 ở 28oC, lắc 200 vòng/phút, trong 5 ngày. Dịch nuôi cấy được ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào. Sau đó rửa cặn lại 2 lần bằng nước cất khử trùng.
Bổ sung 4 ml Extraction Bufer II (0,8 M LiCl; 0,6% Sarcosyl; 10 mM EDTA và 0,2% poly vinyl pyrrolidone- PVP) và 200 µl -mecaptoethanol vào ống ly tâm chứa 0,5 g cặn tế bào. Hỗn hợp được ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó mẫu được lắc nhẹ ở 4o
C trong 1 giờ và ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch trên được chuyển sang ống mới. DNA được tủa bằng 0,1 lần thể tích 3M CH3COONa, 2 lần thể tích của ethanol tuyệt đối, ủ ở -80oC trong 2 giờ và sau đó ly tâm ở 14000 vòng/phút trong 20 phút. Tủa được rửa 2 lần với ethanol 70%, ly tâm thu tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó, tủa được hòa lại trong 50 l nước cất loại ion vô trùng, 0,25 l RNAase và ủ 15 phút ở 37oC (Đặng Diễm Hồng và cs, 2002)
Ưu điểm của phương pháp tách chiết DNA này là không cần nghiền tế bào, không dùng phenol do đó tiết kiệm được thời gian và hóa chất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng DNA thu được đảm bảo độ tinh sạch cao, không bị biến tính. Vi tảo biển với đặc trưng là thành tế bào cứng, chứa nhiều polysaccharide, do vậy, sự có mặt của LiCl sẽ giúp thành tế bào mềm và xốp làm cho việc phá vỡ màng tế bào trở nên dễ dàng hơn. Hiệu quả này được tăng lên nhờ sarkrosyl. PVP có tác dụng loại bỏ phần lớn các polysaccharide có trong dịch chiết.
2.5.3.2. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
Dựa trên trình tự nucleotide đoạn gen 18S rRNA của các loài thuộc chi
Schizochytrium trên GenBank, so sánh các trình tự nhận được và sử dụng các phần
mềm chuyên dụng chúng tôi đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu LabyF - LabyR để nhân một phần đoạn 18S rRNA của 4 chủng Schizochytrium spp. tiềm năng đã lựa chọn. Theo
tính toán lí thuyết, cặp mồi này sẽ nhân được đoạn gen có kích thước vào khoảng 700 bp. Trình tự của cặp mồi như sau: Laby F: 5’-CCTATCAGCTGTCGATGGTA-3’ và Laby R: 5’- GTTAAGACTACGATGGTATCTAA-3’.
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 20 µl bao gồm 2,0 µl đệm 10X cho Taq-DNA polymerase; 1,5 µl dNTP mỗi loại (2,5 mM); 1,0 µl Laby F và Laby R mỗi loại (10 mM); 1,0 µl DNA khuôn (50-100 ng/ µl); 0,3 µl Taq polymerase (5 U/ µl) và 13,2 µl H2O. Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: Bước 1: 94oC - 3 phút; Bước 2: 94oC - 30 giây; Bước 3: 55oC - 30 giây; Bước 4: 72oC - 1 phút; Bước 5: lặp lại 30 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; Bước 6: 72oC - 5 phút; Bước 7: 4oC – vô cùng. Nhiệt độ 94oC là nhiệt độ biến tính DNA từ dạng sợi kép thành sợi đơn. Ở giai đoạn gắn mồi, mồi xuôi và mồi ngược nhận biết vị trí tương đồng ở hai đầu đoạn DNA cần khuyếch đại và quá trình gắn mồi được kết hợp bằng liên kết hydro khi hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ thích hợp. Thời gian kéo dài chuỗi ở 72o
C trong chu trình nhiệt trong 5 phút là phù hợp với độ dài đoạn gen cần khuyếch đại ở trường hợp này. Sản phẩm PCR sau quá trình tổng hợp được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% .
2.5.3.3. Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit tinh sạch của hãng QIAgen. Mẫu DNA được chạy điện di trên gel agarose 0,8% để thu phân đoạn cần tinh sạch. Bổ sung dung dịch liên kết (binding solution) theo tỷ lệ 1 g gel:1 ml dung dịch. Hỗn hợp được ủ ở 55oC trong 15 phút để gel tan hoàn toàn. Đưa dịch DNA lên cột, để ở yên trong 2 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại dịch lỏng. Cột gắn DNA được rửa hai lần với 500 µl dung dịch rửa (washing solution) và ly tâm ở 130000 vòng/phút trong 1 phút. DNA được thôi bằng nước cất khử ion.
2.5.3.4. Tách dòng gen
* Phản ứng nối ghép gen vào vectơ tách dòng pCR® 2.1-TOPO
Phản ứng này được thực hiện theo TOPO TA Cloning Kit® (Invitrogen). Đây là phương pháp thiết kế đặc biệt cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào véctơ tách dòng trong khoảng thời gian rất ngắn (5 phút) nhờ hoạt động của topoisomerase. Hỗn hợp phản ứng gồm dung dịch đệm 10X cho enzyme, véctơ tách dòng pCR® 2.1,
enzyme ligase, sản phẩm PCR, nước khử ion vô trùng. Hỗn hợp phản ứng đặt ở nhiệt độ 25o
C trong 5 phút.
* Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
Sau khi gắn đoạn DNA khuyếch đại vào plasmid, sản phẩm gắn được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 theo phương pháp sốc nhiệt. Việc xử lý tế bào
E. coli DH5 bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt,
có lỗ trên màng tế bào mở rộng làm các đoạn DNA đi vào bên trong một cách dễ dàng. Quá trình biến nạp được thực hiện như sau: 3 µl sản phẩm của phản ứng ghép nối được ủ với tế bào khả biến đã được để trên đá 30 phút. Sau đó, chuyển nhanh vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong 2 phút và ngay lập tức ủ hỗn hợp trong đá 5 phút. Bổ sung 300 µl môi trường SOC, nuôi lắc ở 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung IPTG (50 µg/ml), ampicillin (50 µg/ml), X-gal (50 µg/ml), nuôi ở tủ ấm 37oC qua đêm.
* Phương pháp tách chiết DNA plasmid
Các khuẩn lạc trắng thu được sau khi biến nạp, nghi ngờ có mang đoạn gen chuyển được nuôi lắc (200 vòng/phút) qua đêm ở 37oC trong 2 ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (50 µg/ml). Dịch nuôi tế bào được li tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút để thu cặn tế bào. Hoà cặn tế bào vào 150 µl Sol I để lạnh (25 mM Tris HCl, pH 8; 10 mM EDTA, pH 8; 50 mM glucose). Mẫu được tạo thành dạng huyền phù bằng voltex. Bổ sung 150 µl Sol II (0,2 mN NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ, để trên đá trong thời gian 5-10 phút. Thêm 200 µl Sol III (3M Kali acetate, pH 5,5; 11,5% axít axetic), đảo nhẹ, để trên đá 5 phút. Bổ sung 500 µl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), trộn đều và ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 10 phút nhằm loại bỏ xác tế bào và DNA hệ gen cùng các protein tạp bị kết tủa. Dịch trên chứa DNA plasmid được chuyển sang ống eppendorf mới. DNA plasmid được tủa bằng 2 lần thể tích ethanol và 0,1 lần thể tích sodium acetate nồng độ cuối cùng là 3 M và giữ ở -70oC trong 1 giờ. DNA plasmid được thu bằng ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 30 phút và được rửa lại 2 lần bằng cồn 70%. Phần tủa được làm khô và hòa tan lại trong 40 l
H2O cất khử ion và RNAase 0,1 mg/ml, ủ ở 37oC trong 30 phút để loại RNA. DNA plasmid được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó bảo quản ở -20oC. * Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng enzyme giới hạn
Việc cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn cho phép khẳng định chắc chắn các plasmid tái tổ hợp có mang sản phẩm PCR mong muốn hay không. Thông thường phản ứng cắt bao gồm các thành phần sau: dung dịch đệm thích hợp cho enzyme, DNA plasmid, enzyme giới hạn, và nước khử ion vô trùng. Hỗn hợp được trộn theo tỷ lệ nhất định, sau đó được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.5.3.5. Xác định trình tự gen
Đoạn gen 18S rRNA được xác định trình tự nucleotide trên máy đọc trình tự tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer bằng cách sử dụng bộ hóa chất chuẩn BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing. Trình tự thu được sau đó được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng như DNA Star, Cluxtal X 1.83 và MEGA 3.