Sắc ký là phương pháp tách các chất ra khỏi hỗn hợp dựa trên sự phân bố không đồng đều của chúng giữa hai pha, một pha không chuyển động (gọi là pha tĩnh) và một pha chuyển động (gọi là pha động) [6].
2.1.4.1.Sắc ký bản mỏng (Thin Layer Chromatography - TLC)
Sắc ký bản mỏng gồm pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, pha tĩnh là chất hấp phụ (thường là siliaca gel hoặc nhôm oxit) được tráng thành lớp mỏng trên tấm nhôm hoặc kính. Khi pha động chuyển động trên pha tĩnh kéo các chất di chuyển với những tốc độ khác nhau làm chúng dịch chuyển những đoạn đường khác nhau, sự khác nhau này đặc trưng bằng giá trị Rf.
* Các bước thực hiện sắc ký bản mỏng
- Sắc ký lớp mỏ ng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), dày 0,25 mm, được cắt với chiều rộng thích hợp, dùng bút chì kẻ nhẹ một đường ngang cách mép dưới (tuyến xuất phát) khoảng 1cm, mép trên (tuyến dung môi) khoảng 0,2 - 0,3 cm. Bản mỏng phải được sấy khô trước khi dùng.
- Cho dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp vào bình triển khai sắc ký, đặt vào đó một mẫu giấy lọc rồi đậy kín bình, để yên ít phút đến khi dung môi trong bình ổn định.
- Mẫu chất được pha loãng trong dung môi thích hợp, dùng mao quản nhỏ đưa chất lên bản mỏng sao cho vết chấm nhỏ và tròn ở tuyến xuất phát.
- Dùng máy sấy sấy nhẹ để đuổi hết dung môi khỏi vệt chấm rồi đặt bản mỏng thẳng đứng hoặc lệch 75o so với phương nằm ngang vào bình triển khai sắc ký, chú ý sao cho dung môi trong bình triển khai nằm dưới vạch xuất phát và đi lên đều. Tiến hành triển khai sắc ký đến khi dung môi chạm đến vạch mép trên thì lấy bản mỏng ra .
- Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dù ng thuốc hiện là dung di ̣ch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
Hình 2.2. Mẫu sắc ký bản mỏng
Cách tính: Rf =
0
L L (1): Tuyến dung môi; (2): Vạch xuất phát L : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vệt
L0 : là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tuyến dung môi
2.1.4.2. Sắc ký cột (Column chromatography - CC)
Sắc ký cột hở được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh thường là các hạt có kích thước lớn (50 - 150 µm), được nạp trong một cột bằng thủy tinh. Mẫu chất cần phân tích được đặt ở phần trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp bông thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt ở phía trên. Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phần phía dưới cột, được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra cột. Sắc ký cột có ưu điểm là các dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với lượng lớn mẫu chất.
-Lựa chọn chất hấp thu và dung môi khởi đầu giải ly
Trong sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel loại thường, hợp chất không phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau.
Với hai phân tử không phân cực, phân tử nào có trọng lượng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển chậm hơn so với phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu trong cột hơn so với vài phân tử có tính phân cực nhưng có trọng lượng phân tử nhỏ.
Trước khi triển khai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp. Sau khi chọn hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho sắc ký cột. Giải ly trước tiên bằng dung môi không phân cực và tăng dần tính phân cực cho dung môi giải ly. Phải sử dụng pha tĩnh của sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột giống nhau. Dung môi để giải ly cột là hệ dung môi đã chọn trong phần thực nghiệm, nhưng phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn. Bởi vì silica gel tráng trên bản mỏng có kích cỡ nhuyễn mịn, lại được phun xịt tráng lên bằng áp lực lớn nên có độ chặt khít cao. Trong khi đó, silica gel được dùng trong sắc ký cột với cỡ hạt lớn hơn lại được nạp vào ở áp suất thường nên có tính lỏng lẻo hơn.
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì:
Chất hấp thu phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lượng của mẫu cần sắc ký. Chiều cao của chất hấp thu nạp trong cột cần đạt tỉ lệ: Chiều cao chất hấp thu : đường kính trong của cột vào khoảng (10 : 1).
- Nạp chất hấp thu vào cột
Muốn tách riêng các hợp chất trong hỗn hợp một cách có hiệu quả nhất, chất hấp thu phải được nạp trong cột một cách đồng nhất để hạn chế những dãy xéo, bất thường.
Kích cỡ hạt giữ vai trò quan trọng: Trong sắc ký cột hở, dung môi chảy ra khỏi cột nhờ trọng lực, cho nên nếu sử dụng hạt hấp thu có kích cỡ hạt quá mịn, cột sẽ quá chặt, dung môi không thể chảy ra khỏi cột. Để có thể có một vận tốc chảy có thể chấp nhận được, kích cỡ hạt chất hấp thu phải > 150 µm.
* Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Nếu mẫu chất không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu khô.
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu cần sắc ký (X g) được hòa tan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50X g), cho thêm silica gel cỡ hạt lớn (10X g). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá trình sắc ký cột), thấm ướt phần bột silica gel. Cho một lớp cát dày khoảng 3 - 6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy vào cột để bắt đầu giải ly.
Giải ly cột: Việc sử dụng một loại dung môi sẽ chỉ giải ly ra khỏi cột một số cấu tử nhất định nào đó và một số cấu tử khác có tính phân cực hơn vẫn còn nằm ở đầu cột. Nếu muốn đuổi chúng ra khỏi cột, phải dùng một dung môi có lực mạnh hơn. Trong suốt quá trình sắc ký, cần thay nhiều loại dung môi khác nhau, có lực mạnh tăng dần (độ phân cực tăng dần) để có thể đuổi hết các cấu tử khác ra khỏi cột.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi nào, nhất thiết phải tăng chậm: Thêm từ từ mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào dung môi cũ đang sử dụng.
Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. Điều này được giải thích do alumin hoặc silica gel khi được xáo trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm cho dung môi bốc hơi, hơi sinh
ra tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột. Cột gãy làm mất đi sự liên tục của chất hấp thu, vì thế không tách tốt chất được.
Vận tốc chảy của dung môi giải ly không được quá nhanh (sẽ không kịp cân bằng với chất hấp thu) cũng không được quá chậm hoặc bị cho ngừng lại một thời gian vì lúc đó các dãy chất tan sẽ khuyếch tán hoặc trải dài theo mọi hướng làm xấu quá trình tách. Thường thường trong đa số sắc ký cột, vận tốc giải ly là khoảng 5 - 50 giọt/phút hoặc 1 - 2 cm/phút.
Theo dõi quá trình giải ly cột: Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc khác nhau, đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly ra khỏi cột. Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không màu, nên dung dịch giải ly cũng trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất lấy dung dịch giải ly trong những lọ có đánh số thứ tự. Dung dịch trong những lọ hứng này sẽ được sắc ký trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi ở áp suất thấp các phân đoạn này sẽ cho cao của phân đoạn đó.