Hoạt tính kháng vi khuẩn và nấm của cao chiết từ lá cây Lá giang được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, tại phòng Hóa sinh ứng dụng, Viện Hóa học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Cách tiến hành
Mẫu ban đầu đươ ̣c pha loãng trong DMSO và nước cất tiê ̣t trùng thành mô ̣t dãy 4 nồng đô ̣ theo yêu cầu và mu ̣c đích thử. Nồng đô ̣ thử cao nhất là 128 µg/mL.
* Thử hoạt tính:
Lấy 10 µl dung di ̣ch mẫu thử ở các nồng đô ̣ vào đĩa 96 giếng, thêm 200 µl dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng đô ̣ 5.105 CFU/mL, ủ ở 37oC/24h.
* Xử lý kết quả
- Giá tri ̣ MIC đươ ̣c xác đi ̣nh ta ̣i giếng có nồng đô ̣ chất thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vâ ̣t.
- Giá tri ̣ IC50 đươ ̣c tính toán dựa trên số liê ̣u đo đô ̣ đu ̣c của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.
- Giá tri ̣ MBC đươ ̣c xác đi ̣nh bằng số khuẩn la ̣c trên đĩa tha ̣ch
* Chất tham khảo
- Kháng sinh Ampicillin cho các chủng vi khuẩn Gram (+) với các giá tri ̣ MIC trong khoảng 0,004 - 1,2 µg/mL.
- Kháng sinh Cefotaxim cho các chủng vi khuẩn Gram (-) với giá tri ̣ MIC trong khoảng 0,07 - 19,23 µg/mL.
- Kháng nấm Nystatin cho chủng nấm với giá tri ̣ MIC trong khoảng 2,8 - 5,0 µg/mL.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu
Nguyên liệu lá cây Lá giang được chúng tôi lựa chọn là những lá còn tươi, không bị hư, héo hay úa vàng và tương đối giống nhau về kích thước để không ảnh hưởng đến việc tách chất.
Lá sau khi thu hái được rửa sạch, để ráo nước và phơi khô dưới ánh nắng mặt trời. Trong quá trình phơi cần xới lá thường xuyên để lá được khô đều và sấy lại trong tủ sấy cho khô hẳn. Quá trình này chủ yếu loại bỏ một phần nước trong lá cây Lá giang.
Lá sau khi sấy khô, đem xay nhỏ rồi rây. Quá trình này lặp đi lặp lại đến khi không còn lá cây Lá giang trên rây, thu được bột lá (Hình 3.1). Việc xay tạo bột lá cây Lá giang nhằm mục đích phá vỡ tế bào thực vật giúp cho dung môi dễ thấm vào bột và nhằm làm tăng diện tích tiếp xúc với dung môi.
Hình 3.1. Bột lá của cây Lá giang
3.2. Đánh giá sơ bộ thành phần hóa học từ cao chiết MeOH và EA
Từ bột lá, thông qua phương pháp ngâm chiết sử dụng dung môi MeOH, lọc loại bột lá chúng tôi đã thu được dịch chiết của lá cây Lá giang trong MeOH. Dịch chiết thu được có màu xanh đậm (Hình 3.2). Bằng phương pháp
chưng cất ở áp suất thấp 114 hPa, nhiệt độ 40oC để loại bỏ dung môi MeOH chúng tôi thu được cao chiết MeOH của lá cây Lá giang (Hình 3.3).
Hình 3.2. Dịch chiết MeOH của lá cây Lá giang
Hình 3.3. Cao chiết MeOH của lá cây Lá giang
Toàn bộ cao MeOH tiếp tục hòa với nước và chiết nhiều lần với Hx, thu được hai phần: Phần tan trong Hx và phần dịch nước. Phần tan trong Hx được cô quay chân không loại dung môi thu được cao Hx. Mục đích chiết với Hx để loại bỏ một phần các chất kém phân cực. Phần dịch nước chiết nhiều lần với dung môi EA, thu được dịch chiết EA. Dịch chiết EA đem cô quay chân
không, loại dung môi ở áp suất 114 hPa, thu được cao chiết EA có màu nâu đậm (Hình 3.4).
Hình 3.4. Cao chiết EA của lá cây Lá giang
Để đánh giá sơ bộ thành phần các chất có trong cao chiết MeOH từ lá cây Lá giang chúng tôi đã sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi khác nhau. Đây là phương pháp thường quy giúp định tính kết quả, bước đầu đánh giá sơ bộ thành phần cao chiết là đơn giản hay phức tạp để có biện pháp xử lý.
Cao MeOH, sử dụng TLC với hệ dung môi DCM : EA = 1,5 : 0,01. Kết quả ở Hình 3.5.
Ở Hình 3.5 các kí hiệu (a) là bản mỏng sau khi chạy sắc ký cho hiện với bước sóng UV 254 nm, (b) bản mỏng được xử lý cho hiện với thuốc hiện Ce(SO4)2 ở hệ dung môi DCM : EA= 1,5 : 0,01. Qua TLC cho thấy các chất gần như hấp thụ ở ánh sáng của vùng UV và đều hiện với thuốc hiện Ce(SO4)2. Nhìn chung, kết quả TLC cho thấy thành phần hóa học trong cao chiết MeOH khá phức tạp, có rất nhiều chất trong đó các chất nằm gần nhau. Phần trên của bản mỏng cho thấy chất có hàm lượng nhiều hơn so với các chất ở vị trí giữa bản mỏng, chứng tỏ có nhiều chất kém phân cực. Hệ dung môi này cũng cho thấy hàm lượng các chất ở chân và gần chân rất nhiều, chứng tỏ hệ chưa giải ly được hết chất và phân tách các chất phân cực chưa được tốt. Do đó, chúng tôi không dùng hệ này để đánh giá thành phần hóa học của cao EA mà thay đổi hệ dung môi Hx : EA = 2 : 0,3 để dùng cho đánh giá thành phần hóa học của các chất trong cao EA. Cao chiết EA được chiết từ cao MeOH sau khi đã loại các chất tan trong Hx. Hình 3.6 là TLC của cao chiết EA.
Hình 3.6. TLC của cao chiết EA hiện màu với Ce(SO4)2
Từ kết quả sắc ký bản mỏng Hình 3.5 và Hình 3.6 cho thấy cao chiết từ Lá giang có thành phần rất phức tạp, có rất nhiều chất. So với cao MeOH thì các chất trong cao EA có phần ít phức tạp hơn. Các chất phía trên bản mỏng của cao EA gần như không còn, chứng tỏ đã loại được một số chất kém phân
cực. Các chất ở giữa bản mỏng cũng có hàm lượng ít. Đặc biệt, chất có hàm lượng lớn ở gần chân đã có sự phân vạch rõ hơn và có khoảng cách xa với các chất hơn. Do đó, chúng tôi có thể phân lập chất ở phần dưới trong TCL do có hàm lượng tương đối lớn và tách biệt với các chất khác trong cao chiết EA bằng phương pháp sắc ký cột, sử dụng hệ dung môi Hx : EA = 2 : 0,3 để làm dung môi rửa giải.
3.3. Định tính các lớp chất chính có trong lá của cây Lá giang
Cao chiết MeOH thu được chúng tôi tiến hành xác định các lớp chất có trong Lá giang: Triterpenoid, alkaloid, steroid, hợp chất phenol và flavonoid. Việc xác định các lớp chất giúp định hướng cho việc tách chất ra khỏi thực vật. Chúng tôi sử dụng các thuốc thử đặc trưng riêng của từng lớp chất (triterpenoid, alkaloid, steroid, hợp chất phenol và flavonoid) để xác định sự có mặt của chúng trong lá cây Lá giang [6].
3.3.1. Phát hiện triterpenoid
Có rất nhiều phương pháp và các loại thuốc thử để phát hiện sự có mặt của triterpenoid trong thực vật. Trong thực nghiệm này, chúng tôi sử dụng thuốc thử là Liebermann - Burchard để xác định lớp chất triterpenoid có mặt trong Lá giang hay không. Phản ứng dương tính khi dung dịch đổi thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ. Hình 3.7 cho kết quả dung dịch chuyển màu xanh lục, chứng tỏ trong lá có chứa các hợp chất thuộc triterpenoid.
3.3.2. Phát hiện alkaloid
Có rất nhều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với alkaloid nhưng các kết quả này cũng có thể cho kết quả dương tính với các hợp chất như: Coumarine, polyphenol, purine, amino acid, protein, acid triterpene, hợp chất có chứa nitrogen….
Có 3 thuốc thử thông dụng là Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn có các thuốc thử khác để phát hiện các loại alkaloid đặc thù. Trong điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng thốc thử Wagner để phát hiện sự có mặt của alkaloid trong Lá giang, nếu dung dịch chuyển sang màu nâu chứng tỏ trong Lá giang có chứa alkaloid. Kết quả Hình 3.8 cho thấy dung dịch đã chuyển sang màu nâu (Hình 3.8 b), chứng tỏ trong lá có chứa các hợp chất thuộc lớp chất alkaloid.
a b
Hình 3.8. Kết quả định tính alkaloid bằng thuốc thử Wagner
3.3.3. Phát hiện hợp chất phenol
Để phát hiện các loại hợp chất phenol, có thể sử dụng những thuốc thử chung như: Dung dịch 4-nitroaniline, thuốc thử FeCl3, thuốc thử Millon… hoặc cũng có thể dùng những thuốc thử riêng cho từng loại: Dùng vaniline,
HCl để phát hiện catechol, dùng thuốc thử acetate magnesium để phát hiện ra quinon, dùng thuốc thử gelatine để phát hiện ra tanin… Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng thuốc thử FeCl3 là thuốc thử đặc trưng và rất thông dụng để phát hiện hợp chất phenol.
Kết quả Hình 3.9 cho thấy, khi sử dụng thuốc thử FeCl3 dung dịch chuyển sang màu xanh đen (Hình 3.9 b), chứng tỏ trong thành phần của lá cây Lá giang có chứa các loại hợp chất phenol.
a b
Hình 3.9. Kết quả định tính các hợp chất phenol bằng thuốc thử FeCl3
3.3.4. Phát hiện Steroid
Steroid được phát hiện cũng tương tự triterpenoid, có thể sử dụng các thuốc thử chung như: Liebermann - Burchard, Rosenhelm, Rosenthaler, Noller... Tuy nhiên, cũng có một số thuốc thử riêng để nhận biết steroid, chẳng hạn như dùng phản ứng Salkowski, dùng thuốc thử Komarowsky... Ở đây chúng tôi sử dụng phản ứng Salkowski để phát hiện steroid.
Kết quả thực nghiệm ở Hình 3.10 a có màu xanh, chứng tỏ trong lá của cây Lá giang có chứa lớp chất steroid.
a b
Hình 3.10. Kết quả định tính Steroid bằng phản ứng Salkowski
3.3.5. Phát hiện flavonoid
Có rất nhiều phương pháp để phát hiện flavonoid: Dùng H2SO4 đậm đặc, dùng NaOH/ethanol 1%, dùng AlCl3/ethanol 1%, dùng phản ứng Cyanidin của Wilstatter... Chúng tôi sử dụng sulfuric acid để phát hiện flavonoid. Kết quả Hình 3.11 cho thấy không có sự biến đổi màu, chứng tỏ trong lá cây Lá giang không chứa các chất lớp flavonoid.
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh đến hiệu suất thu cao chiết MeOH của lá cây Lá giang Lá giang
Nội dung nghiên cứu chúng tôi là phân lập, xác định cấu trúc và nghiên cứu tính chất phổ của hợp chất tách từ lá của cây Lá giang. Hợp chất được phân lập không trực tiếp tách ra từ bột lá mà thông qua cao chiết. Vì thế hiệu suất trích ly cao chiết từ bột lá có ảnh hưởng khá lớn đến hiệu suất chất phân lập sau này. Trong đề tài này, cao chiết được chúng tôi trích ly theo 3 phương pháp đó là phương pháp ngâm chiết, phương pháp chiết soxhlet và phương pháp chiết siêu âm. Trong mỗi phương pháp, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Ở đây chúng tôi nghiên cứu khảo sát 2 yếu tố ảnh hưởng đó là yếu tố tỉ lệ giữa khối lượng mẫu và thể tích dung môi và yếu tố thời gian đến hiệu suất trích ly cao chiết của từng phương pháp trên.
3.4.1. Phương pháp ngâm chiết
Phương pháp ngâm chiết, chúng tôi nghiên cứu khảo sát 2 yếu tố ảnh hưởng đó là: Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang với thể tích dung môi và ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hiệu suất trích ly cao chiết MeOH.
3.4.1.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá của cây Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến hàm lượng cao chiết trong phương pháp ngâm chiết
Ngâm chiết là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Vì vậy, đối với việc ngâm chiết tỉ lệ giữa lượng bột lá của cây Lá giang với thể tích dung môi hòa tan là rất quan trọng. Tỉ lệ này không thích hợp sẽ dẫn đến chiết không kiệt các chất hữu cơ có trong thực vật hoặc sẽ dư thừa lượng dung môi gây lãng phí. Để trích ly hầu hết các chất có trong lá thực vật, có thể dùng nhiều loại dung môi, tuy nhiên dung môi thuận lợi cho việc tách các chất ra khỏi thực vật, được sử dụng thường xuyên và phù hợp với thí nghiệm hiện có là MeOH. Do đó, dung môi MeOH được chúng tôi
chọn làm dung môi để nghiên cứu tạo cao chiết, từ dó khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khối lượng cao chiết. Trong phương pháp ngâm chiết, chúng tôi nghiên cứu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đầu tiên là ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá của Lá giang và thể tích dung môi, từ đó tìm ra tỉ lệ tốt nhất để sử dụng cho các nghiên cứu khảo sát sau.
Dung môi sử dụng là MeOH, khối lượng bột lá cây Lá giang cho mỗi khảo sát là 20 g, thời gian ngâm chiết là 72 giờ. Kết quả thu được ở Bảng 3.1 như sau:
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích MeOH đến hàm lượng cao chiết trong ngâm chiết
Thể tích MeOH (mL) 100 150 200 250
Tỉ lệ m bột (g) : V dung môi (mL) 1 : 5 1 : 7,5 1 : 10 1 : 12,5 Khối lượng cao chiết (g) 1,91 3,10 3,41 3,41
Hiệu suất (%) 9,55 15,50 17,05 17,05 9.55 15.5 17.05 17.05 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1 : 5,0 1 : 7,5 1 : 10,0 1 : 12,5 H àm lượ ng %
Tỉ lệ bột Lá giang (g) : thể tích dung môi (mL)
Hình 3.12. Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của tỉ lệ bột lá cây Lá giang (g) : thể tích MeOH (mL) đến hàm lượng cao chiết MeOH trong ngâm chiết
Kết quả trên cho thấy: Khi thể tích dung môi MeOH càng tăng hay tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang với thể tích dung môi MeOH tăng (m/v =
g/mL) từ 1 : 5 đến 1 : 12,5 thì hàm lượng cao chiết thu được càng nhiều, hiệu suất chiết càng tăng (9,55% - 17,05%). Điều này có thể được giải thích như sau: khi thể tích dung môi tăng, khả năng các chất hữu cơ trong thực vật hoà tan vào dung môi tăng dẫn đến khối lượng cao chiết thu được cũng tăng theo. Khi thể tích dung môi MeOH tăng từ 200 mL - 250 mL tương ứng với tỉ lệ (1 : 10 đến 1 : 12,5) hiệu suất chiết không đổi, cho thấy tỉ lệ 1 : 12,5 này thì lượng dung môi quá thừa, các chất hữu cơ trong thực vật đã hoà tan hết và dung dịch đã bảo hòa, nên khi tăng thêm thể tích dung môi đã không còn tác dụng hòa tan chất nữa mà chỉ làm hao phí dung môi.
Từ kết quả thí nghiệm khảo sát trên chúng tôi chọn tỉ lệ giữa khối lượng bột Lá giang (g) và thể tích dung môi MeOH (mL) là 1 : 10 để nghiên cứu khảo sát các ảnh hưởng tiếp theo.
3.4.1.2. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết
Thời gian ngâm chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Nếu ngâm nhanh thì sẽ không đủ thời gian trích ly và cũng không thể ngâm lâu quá sẽ ảnh hưởng đến công sức, thời gian và chất lượng cao chiết. Khi nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến lượng cao chiết, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các thời gian khác nhau là: 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ và 84 giờ với tỉ lệ khối lượng bột lá cây Lá giang (g) và thể tích dung môi (mL) là 1 : 10. Kết quả thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết
Thời gian (giờ ) 24 36 48 60 72 84
Khối lượng cao chiết (gam ) 1,11 1,89 3,07 3,38 3,41 3,41 Hiệu suất ( %) 5,55 9,45 15,35 16,90 17,05 17,05
Thời gian cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Mặc dù sử dụng đủ lượng dung môi nhưng không đủ thời gian để các chất
khuếch tán vào dung môi thì cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly. Tuy nhiên cũng không nên kéo thời gian chiết quá lâu.
5.55 9.45 15.35 16.9 17.05 17.05 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 24 36 48 60 72 84 H àm lượ ng %
Thời gian (giờ)
Hình 3.13. Đồ thị biễu diễn sự ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hàm lượng cao chiết MeOH
Từ đồ thị Hình 3.13 cho thấy: Khi ngâm trong 24 giờ hiệu suất cao chiết thu được rất thấp (5,55%) là do dung môi chưa hòa tan được nhiều chất tan và