2.3.5.1. Phương pháp ngâm chiết
* Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến hàm lượng cao chiết
Để khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến khối lượng cao chiết trong phương pháp ngâm chiết. Chúng tôi tiến hành với khối lượng là 20 g bột lá cây Lá giang, thời gian ngâm và khuấy là 72 giờ ở nhiệt độ phòng cho mỗi lần khảo sát. Thể tích dung môi MeOH thay đổi lần lượt là 100 mL; 150 mL; 200 mL; 250 mL. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1.
* Ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu
Sau khi khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột lá cây Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến khối lượng cao chiết, chúng tôi chọn được tỉ lệ thích hợp nhất và tiến hành khảo sát đến sự ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu (24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ) đến khối lượng cao chiết, mỗi mẫu được tiến hành với khối lượng là 20 g bột lá cây Lá giang, ngâm trong 200 mL MeOH. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.2.
2.3.5.2. Phương pháp chiết soxhlet
Ở phương pháp này chúng tôi chỉ xét yếu tố ảnh hưởng của thời gian đun mẫu đến hàm lượng cao chiết MeOH.
Cho 20 g bột lá cây Lá giang đã xay nhỏ vào túi vải, rồi đặt vào thân soxhlet, lắp dụng cụ như Hình 2.8. Rót từ từ dung môi MeOH vào bình cầu qua ống sinh hàn sao cho dung môi thấm đều túi bột lá cây Lá giang trước khi chảy xuống bình cầu, thể tích dung môi MeOH đo được là 90 mL.
Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian đun mẫu (3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ; 4,5 giờ; 5 giờ) đến khối lượng cao chiết, mỗi mẫu được tiến hành với khối lượng là 20 g bột lá cây Lá giang, 90 mL MeOH. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.3.
Hình 2.8. Hệ thống chiết soxhlet dùng trong thí nghiệm
2.3.5.3. Phương pháp chiết siêu âm
Cân 20 g bột lá cây Lá giang và 140 mL dung môi MeOH vào bình cầu dung tích 250 mL, lắp thiết bị như Hình 2.9 giữ nhiệt độ bồn siêu âm ở 40oC và siêu âm ở tần số 37 kHz.
Ở phương pháp chiết siêu âm chúng tôi khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột Lá giang với thể tích dung môi MeOH và ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hàm lượng cao chiết MeOH.
Hình 2.9. Thiết bị chiết siêu âm dùng trong thí nghiệm
* Ảnh hưởng của tỉ lệ giữa khối lượng bột Lá giang và thể tích dung môi MeOH đến hàm lượng cao chiết
Khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích dung môi MeOH (80 mL; 100 mL; 120 mL; 140 mL và 160 mL) đến khối lượng cao chiết, mỗi mẫu được tiến hành với khối lượng là 20 g bột Lá giang, thời gian siêu âm là 30 phút. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.4.
* Ảnh hưởng của thời gian siêu âm
Sau khi khảo sát sự ảnh hưởng của lượng dung môi đến khối lượng cao chiết, chúng tôi chọn được tỉ lệ giữa khối lượng bột Lá giang và thể tích dung môi MeOH thích hợp nhất và tiến hành khảo sát đến sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm mẫu (10 phút, 20 phút, 30 phút và 40 phút) đến khối lượng cao chiết, mỗi mẫu được tiến hành với khối lượng là 20 g bột Lá giang với 140 mL dung môi MeOH. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.5.
2.3.6. Nghiên cứu phân lập hợp chất từ cao chiết EA
Cột đã được nhồi silica gel để thực hiện sắc ký cột. Tiến hành tẩm silica gel với 10,031 g cao chiết EA, sau đó cho lên cột và chạy sắc ký cột. Dung
môi rửa giải lúc đầu là Hx sau đó là hệ dung môi Hx : EA tăng dần (từ 2 : 0,1; 2 : 0,2; 2 : 0,3), thu được 4 phân đoạn, trong đó, chúng tôi tập
trung vào phân đoạn 3 để phân lập chất. Phân đoạn 3, sau khi cô quay chân không đuổi dung môi thu được 0,165 g.
Đem phân đoạn 3, chạy lại sắc ký cột 2 lần với dung môi rửa giải là DCM : MeOH thu được chất, kiểm tra TLC với hệ dung môi DCM : MeOH = 35 : 1 thu được chất có Rf = 0,44. Cất đuổi dung môi ở nhiệt độ 40oC, áp suất 90 hPa thu được 5 mg chất rắn bột có màu trắng. Tiến hành đo các phổ MS,
1H NMR, 13C NMR, DEPT để xác định cấu trúc. Kết quả cụ thể được trình bày trong Chương 3.
Trong quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã xác định được quy trình tách chiết hợp chất từ Lá giang thể hiện qua Hình 2.11.
Hình 2.11. Quy trình tách chiết hợp chất từ lá của cây Lá giang