Trong đề tài nghiên cứu này chúng tôi tập trung phân lập hợp chất tách từ lá cây Lá giang thông qua cao chiết EA.
Qua sắc ký bản mỏng của cao chiết EA (Hình 3.6), chúng tôi nhận thấy có quá nhiều chất với độ phân cực rải đều và gần nhau nên chúng liên kết với nhau, khó bị bức tách trong dung môi để tạo thành tinh thể tinh khiết khi tiến hành kết tinh. Do đó, chúng tôi nghiên cứu phân lập hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột.
Từ kết quả đánh giá sơ bộ bằng TLC của cao EA ở trên (Hình 3.6) cho thấy trong cao EA có xuất hiện chất ở dưới bản mỏng có hàm lượng nhiều và nằm cách với chất trên và chất dưới chân, điều này cũng thuận lợi cho việc tách chất bằng phương pháp sắc ký cột.
Thực hiện sắc ký cột từ cao chiết EA với chất hấp phụ là silica gel và hệ dung môi rửa giải là Hx : EA = 2 : 0,3. Do chất dự định tách tương đối rõ vạch và nằm cách với chất trên và chất dưới chân, nên đầu tiên chúng tôi tiến hành tách nhanh qua cột silica gel ngắn có tỉ lệ silica gel : chất = 8 : 1 (g/g). Cột sắc ký sau khi nhồi và nén xong để ổn định một thời gian, tiến hành tẩm silica gel với 10,031 gam mẫu của cao chiết EA (Hình 3.17), sau đó cho vào cột và tiến hành chạy sắc ký cột để tách chất.
Hình 3.17. Cao chiết EA đã được tẩm silica gel
Dùng các lọ thủy tinh sạch có đánh số theo thứ tự tăng dần để hứng dung dịch ra khỏi cột. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau để hạn chế các chất lẫn nhau nhiều. Dung dịch trong các lọ hứng được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng, chất có cùng và gần giá trị Rf do bị lẫn được dồn chung lại với nhau thành một phân đoạn, kết quả thu được 4 phân đoạn. Trong 4 phân đoạn thì phân đoạn 3 có chứa chất cần quan tâm chiết tách, cô đuổi dung môi ở phân đoạn này thu được 0,165 g chất có màu xanh (Hình 3.18). Phân đoạn 3 được tiếp tục chạy qua 2 lần sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là DCM : MeOH = 35 : 1.
Lần thứ nhất chạy sắc ký cột của phân đoạn 3, chúng tôi thu được 0,045 g chất và được kiểm tra sơ bộ độ sạch của chất bằng sắc ký bản mỏng ở Hình 3.19.
Hình 3.19. TLC của phân đoạn 3 chạy cột lần thứ nhất
Kết quả TLC lần thứ nhất của phân đoạn 3 cho thấy, chất cần tách chưa được sạch, các chất phía trên đã dược loại hết nhưng vẫn còn lẫn các chất phía dưới chân. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tinh chế bằng cách chạy qua sắc ký cột lần 2.
Sau khi chạy sắc ký cột lần 2, chúng tôi thu được chất rắn bột màu trắng, có khối lượng 8 mg, kiểm tra lại TLC với hệ DCM: MeOH = 35 : 1 chỉ thấy có 1 vệt duy nhất trên bản mỏng (Rf = 0,44), thể hiện ở Hình 3.20.