3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.3.1.1. Thí nghiệm 1: Phân tích thành phần hóa học của nấm vân chi
Nấm nguyên liệu sau thu hái có độ ẩm cao và không đồng đều do chế độ trồng và thời điểm thu hái không đồng nhất. Để tạo ra sự đồng đều ở các mẫu thí ngiệm, tiến hành sấy sơ bộ bằng phương pháp sấy tiếp xúc ở 40oC trong 4 giờ và tiến hành phân tích các chỉ tiêu lý hóa chủ yếu của nấm vân chi.
2.3.1.2. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến độ ẩm nguyên liệu theo thời gian
Sau khi sấy nấm bằng phương pháp sấy tiếp xúc ở 40oC trong 4 giờ, tiếp tục nâng nhiệt độ và sấy cho đến khi độ ẩm nguyên liệu đạt dưới 10% thì kết thúc quá trình sấy.
Các nhiệt độ được lựa chọn để khảo sát trong quá trình sấy là 500C, 550C, 600C và 650C. Mẫu sấy được xác định độ ẩm sau mỗi 60 phút trong suốt quá trình sấy.
2.3.1.3. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu tỷ lệ phối trộn nguyên liệu bổ sung
* Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung trà nguyên liệu:
Trên cơ sở tham khảo một số đề tài nghiên cứu về trà túi lọc nấm linh chi và các loại trà túi lọc khác, tôi lựa chọn bố trí thí nghiệm với 5 công thức tương ứng với tỷ lệ phối trộn nấm vân chi : trà nguyên liệu như sau:
Công thức 1: tỷ lệ 1:0,1 (CT1) Công thức 2: tỷ lệ 1:0,2 (CT2) Công thức 3: tỷ lệ 1:0,3 (CT3) Công thức 4: tỷ lệ 1:0,4 (CT4) Công thức 5: tỷ lệ 1:0,5 (CT5)
Sau khi phối trộn tiến hành pha trà với tỷ lệ 2 g trà/150 ml nước nóng 90 – 95oC và tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
*Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung cỏ ngọt:
Trên cơ sở lựa chọn được tỷ lệ bổ sung trà nguyên liệu được ưa thích tiến hành nghiên cứu tỷ lệ bổ sung cỏ ngọt. Thí nghiệm được tiến hành với 5 công thức như sau:
Công thức 6: tỷ lệ 0,05 (CT6) Công thức 7: tỷ lệ 0,08 (CT7) Công thức 8: tỷ lệ 0,11 (CT8) Công thức 9: tỷ lệ 0,14 (CT9) Công thức 10: tỷ lệ 0,17 (CT10)
Sau khi phối trộn tiến hành pha trà với tỷ lệ 2 g trà/150 ml nước nóng 90 – 95oC và tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.4. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng nước pha trà đến chất lượng cảm quan trà thành phẩm
Trên cơ sở lựa chọn được công thức phối trộn tiến hành nghiên cứu lượng nước pha trà. Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức tương ứng với lượng nước pha cho 2 g trà như sau:
Công thức 11: 130ml nước (CT11) Công thức 12: 150ml nước (CT12)
Công thức 13: 170ml nước (CT13)
Tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.5. Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian hãm trà đến chất lượng cảm quan trà thành phẩm
Trên cơ sở lựa chọn được công thức phối trộn và lượng nước pha trà, tiếp tục tiến hành nghiên cứu thời gian hãm trà. Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức như sau:
Công thức 14: hãm trà trong 5 phút (CT14) Công thức 15: hãm trà trong 10 phút (CT15) Công thức 16: hãm trà trong 15 phút (CT16)
Tiến hành đánh giá cảm quan để lựa chọn công thức được ưa thích.
2.3.1.6. Thí nghiệm 6: Phân tích hàm lượng PSP, PSK trong nấm vân chi nguyên liệu, sản phẩm và nước pha trà thành phẩm
- Xác định khối lượng thô PSP, PSK: Tiến hành trích ly với dung môi là nước để xác định hàm lượng PSP, PSK [7], [26].
- Phân tích protein bằng phương pháp điện di và Bradford:
PSP/PSK trong các mẫu thí nghiệm được tách chiết bằng nước cất trước khi đưa đi kết tủa và chạy điện di trên SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel). Các mẫu được chuẩn bị riêng biệt với 10 g nấm tươi, 10 g nấm khô và 10 g trà thành phầm (sau khi phối trộn với nguyên liệu phụ) được tách chiết 3 lần với 250 ml nước cất mỗi lần (theo sơ đồ 1.3). Tổng 750 ml lượng dịch chiết được cô quay chân không ở 800C cho đến khi thu được 100 ml. Cho 45 g muối amôn sulfate (ammonium sulfate) vào 100 ml dịch cô quay để đạt được độ bão hòa 70%, khuấy đều đến khi muối tan hoàn toàn trong dung dịch, sau đó để ở 40C trong 4 giờ trước khi ly tâm ở 4oC, 12.000 vòng/phút để thu kết tủa. Lượng tủa này được hòa tan lại trong 5 ml nước cất và đưa đi thẩm tách 12 giờ trước khi lấy 30 µl để sử dụng bơm vào giếng điện di gel.
SDS-PAGE sử dụng cho thí nghiệm phân tách protein này là ở 10% như được mô tả trong tài liệu “Hướng dẫn điện di và phát hiện protein trên gel polyacrylamide” của hãng Bio-Rad. 30 µL mẫu trộn với 5 µL dung dịch nhuộm protein, đun sôi hỗn hợp trong 5 phút, giữ lạnh trong đá 10 phút và bơm vào giếng trên phần gel cô (stacking gel). Sau khi protein được phân tách trong gel tách (separation gel) bằng quá trình điện di ở 120 voltage, trong khoảng 2,5 giờ, sau đó gel được tách khỏi hệ thống chạy gel và với thuốc nhuộm liên kết protein Coomassie brilliant blue. Protein trên gel được quan sát và ghi hình bằng máy đọc gel.
Để biết lượng protein tổng số đã dùng cho thí nghiệm chạy gel, tôi tiến hành đo protein tổng số bằng phương pháp Bradford dựa theo tài liệu của Bio-Rad “Quick Start Bradford protein assay” và đo mật độ quang ở bước sóng ʎ = 595 nm. Trong thí nghiệm này tôi sử dụng BSA (Bovine serum albumin) để xây dựng đường chuẩn.
2.3.2. Phương pháp vật lý
2.3.2.1. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Sấy mẫu ở nhiệt độ 105oC làm bay hết hơi nước. Cân khối lượng nguyên liệu trước và sau khi sấy khô, từ đó tính phần trăm nước có trong nguyên liệu.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.1.1) Tính kết quả: Độ ẩm theo % (X) tính bằng công thức: X = ( ) ) ( 100 1 2 1 G G X G G − − Trong đó: - X: độ ẩm nấm (%) - G: khối lượng cốc sấy
- G1: khối lượng của cốc sấy và mẫu trước khi sấy (g) - G2: khối lượng của cốc sấy và mẫu sau khi sấy (g)
2.3.2.2. Xác định hàm lượng tro
Dùng nhiệt độ 550 - 600oC để đốt cháy hoàn toàn các chất hữu cơ, phần tro trắng còn lại đem cân ta được tro toàn phần.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.1.2) Tính kết quả:
Hàm lượng tro (%) được tính theo công thức:
1 0 0 2 ) 100 ( % G G G G X − − = Trong đó: - X: hàm lượng tro (%) - G0: trọng lượng cốc nung (g)
2.3.3. Phương pháp hóa sinh
2.3.3.1. Xác định đường khử bằng phương pháp Bertrand
Xác định hàm lượng các đường monosaccharide có trong nguyên liệu dựa vào phản ứng oxy hóa giữa đường khử với ion kim loại. Dựa vào lượng KMnO4 sử dụng ta có thể tính được lượng Cu2O và từ đó tính được lượng đường khử trong dung dịch bằng cách tra bảng tỉ lệ giữa dung dịch KMnO4 (1/30 N) và đường khử của Bertrand
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.1) Tính kết quả:
Hàm lượng đường khử tính theo công thức sau: X = 1000 100 1 w V V a Trong đó:
+ X: hàm lượng đường khử của thực phẩm (%)
+ a: số mg glucose tìm được khi tra bảng ứng với số ml KMnO4 1/30 N dùng để chuẩn độ
+ V: dung tích bình định mức (ml)
+ V1: lượng dung dịch lấy ra để xác định đường khử (ml) + w: khối lượng mẫu lấy làm thí nghiệm (g)
+ 100: hệ số tính chuyển đổi thành % + 1000: hệ số đổi gam thành miligam
2.3.3.2. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldah
Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng NH3 bằng dung dịch H2SO4 0,1N. Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.2) Tính kết quả: Nitơ tổng số (%) = p V 1,42100 Trong đó: - V: số ml H2SO4 0,1N chuẩn độ
- 1,42: số mg N tương ứng với 1ml H2SO4 0,1N - p: lượng mẫu phân tích (mg)
2.3.3.3. Xác định hàm lượng cellulose
Định lượng cellulose dựa trên tính chất bền của cellulose đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu. Các chất khác thường đi kèm theo cellulose như hemicellulose, ligin, tinh bột,… ít bền hơn tác dụng của acid và kiềm nên bị oxy hóa và phân giải sau đó tan vào dung dịch ngay sau khi xử lý nguyên liệu.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.3) Tính kết quả:
- Hàm lượng cellulose (%) được tính theo công thức
m a
X% = 100
Trong đó:
- X: hàm lượng cellulose của nấm vân chi (%) - m: khối lượng mẫu ban đầu (g)
2.3.3.4. Xác định hàm lượng chất béo
Dùng ether nóng để hòa tan và chiết rút tất cả lipid tự do trong nguyên liệu trong thiết bị Soxhlet. Sau khi làm bay hơi hết ether, sấy mẫu đến khối lượng không đổi, cân và tính ra hàm lượng lipid trong thực phẩm.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.4) Tính kết quả:
- Hàm lượng chất béo (%) được tính theo công thức:
1 2 1 ) 100 ( % G G G X − = Trong đó:
- X: hàm lượng lipid của nấm vân chi (%) - G: khối lượng mẫu trước khi tách lipid (g) - G2: khối lượng mẫu sau khi tách lipid (g)
2.3.3.5. Xác định khối lượng thô PSP, PSK [21] [26]
PSP, PSK là hoạt chất tan và bền trong nước nóng nhưng lại không tan trong các dung môi như methanol, benzene, pyridine, clorofom,… và có khả năng chống chịu tốt với enzyme thủy phân protein nên để phân tích hàm lượng PSP người ta thường trích
ly bằng nước nóng trong thời gian dài. Mặt khác PSP kết tủa được với cồn do đó dùng cồn để tủa các PSP này, PSK kết tủa với muối amonisunphate
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.5; 1.2.6) Tính kết quả: 1 2 1 ) 100 ( % G G G X = − Trong đó: - X: hàm lượng PSP, PSK (%)
- G1: khối lượng mẫu trước khi chiết (g) - G2: khối lượng mẫu sau khi đông khô (g)
2.3.3.6. Phương pháp SDS-PAGE
Phương pháp SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được Weintraub và cộng sự sử dụng lần đầu tiên vào năm 1959. Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân tách theo trọng lượng dưới tác dụng của điện trường không đổi. Protein được phân tách trong gel polyacrylamide với dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thước khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu ở các tốc độ khác nhau nên chúng sẽ dừng lại ở các vị trí khác nhau trên gel khi ngừng quá trình điện di. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích được loại trừ.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 1 (1.2.7)
2.3.4. Phương pháp vi sinh
2.3.4.1. Xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn sinh trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Chỉ số này được xác định bằng kỹ thuật đổ đĩa và đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định, xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 2 (2.1) Tính kết quả:
Tổng số vi khuẩn hiếu khí được tính theo công thức sau:
i i i V f n f V n f V n N X + + = ... % 2 2 2 1 1 1
Trong đó:
+ A: tế bào vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu
+ N: tổng số khuẩn lạc đã đếm được trên các đĩa đã chọn + ni: số lượng đĩa cấy tại nồng độ pha loãng thứ i
+ V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa + fi: độ pha loãng tương ứng
2.3.4.2. Xác định E.coli và tổng số Coliform [15]
Coliforms là những trực khuẩn Gram (-), hiếu khí và kỵ khí tùy tiện, không sinh
bào tử. Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị, số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các loại vi sinh vật khác. Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: E.coli, Citrobacter,
Klebsiella, Enterobacter. Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp
của nhóm vi khuẩn này, có thể xác định bằng phương pháp MPN (most probable number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp khác nhau 10 lần).
Mẫu được đồng nhất và pha loãng thành các nồng độ thích hợp rồi được ủ trong các ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ với 3 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện của E.coli trong từng ống nghiệm, ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính và dựa vào bảng MPN để tính kết quả.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 2 (2.2)
2.3.4.3. Phân tích định tính Salmonella
Salmonella là trực khuẩn Gram (-), hiếu khí và kỵ khí tùy tiện, có khả năng di
động, không tạo bào tử, không sinh indol, không phân giải ure, hầu hết các chủng đều sinh H2S. Salmonella có thể được phát hiện bằng 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.
Phương pháp tiến hành: Phụ lục 2 (2.3)
2.3.5. Phương pháp đánh giá cảm quan theo phép thử thị hiếu người tiêu dùng [19]
Để lựa chọn các thông số sử dụng trong sản xuất trà túi lọc vân chi như tỷ lệ phối trộn nguyên liệu phụ, tỷ lệ nước pha, thời gian hãm trà tôi tiến hành đánh giá cảm quan bằng phép thử cho điểm thị hiếu để lựa chọn mẫu người tiêu dùng ưa thích nhất.
Phép thử cho điểm thị hiếu là phép thử được thực hiện trên số đông người tiêu dùng để tìm hiểu mức độ hài lòng, ưa thích của họ đối với sản phẩm nghiên cứu. Người thử sẽ
bằng thang điểm đã được quy định trước thông qua thuật ngữ mô tả cấp độ hài lòng ưa thích - thang đo thị hiếu 9 điểm. Nó được giới hạn bởi 2 đầu nút “cực kỳ thích” và “cực kỳ không thích”.
Cực kỳ không thích: 1 Tương đối thích: 6
Rất không thích: 2 Thích: 7
Không thích: 3 Rất thích: 8
Tương đối không thích: 4 Cực kỳ thích: 9 Không thích cũng không ghét: 5
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thí nghiệm được xử lý sơ bộ trên Excel, phân tích phương sai ANOVA so sánh các giá trị trung bình bằng hàm Duncan trên phần mềm thống kê SPSS 2.0, chạy trên môi trường Window.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NẤM VÂN CHI (TRAMETES
VERSICOLOR)
Nấm nguyên liệu sau thu hái có độ ẩm cao và không đồng đều do chế độ trồng và thời điểm thu hái không đồng nhất. Sau khi phân tích hàm ẩm ở 9 mẫu nấm, tôi thu được kết quả độ ẩm trung bình của nấm khoảng 54,3%. Để tạo ra sự đồng đều ở các mẫu thí ngiệm, tôi tiến hành sấy sơ bộ bằng phương pháp sấy tiếp xúc ở 400C trong 4 giờ và sử dụng mẫu này cho các nghiên cứu tiếp theo. Một số thành phần lý hóa chủ yếu của nấm cũng được phân tích sau giai đoạn này, kết quả được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Một số chỉ tiêu lý hoá của nấm vân chi (tính trên 100g nấm vân chi khô)
( N=3) TT Thành phần Giá trị (%) 1 Độ ẩm 37,65 ± 0,24 2 Tro 3,51 ± 0,21 3 Protein 11,60 ± 0,27 4 Lipid 0,56 ± 0,04 5 Cellulose 41,01 ± 0,01 6 Đường khử 7,16 ± 0,20
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, độ ẩm trung bình của nấm nguyên liệu sau khi sấy sơ bộ đạt 37,65%. Các thành phần khác gồm hàm lượng tro, protein nitơ, chất béo (lipid), cellulose và đường khử lần lượt là 3,51%, 11,6%, 0,56%, 41,01% và 7,16%. So với nấm rơm, là loại nấm ăn phổ biến thì thành phần protein trong nấm vấn chi phân tích được thấp hơn rất nhiều, 11,6% so với 93,95%. Tuy nhiên, khi so sánh với các