3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.7.2. Phân tích trên gel SDS-PAGE và Bradford
PSP và PSK là những hợp chất liên kết giữa polysaccharide với protein và là những thành phần có dược tính trong nấm vân chi. Theo phân tích của Ng. Tzibun (1998), PSP và PSK tách chiết từ nấm vân chi đều có khối lượng phân tử vào khoảng 100 kDa. Trong nghiên cứu này, tôi khảo sát sự có mặt của PSP, PSK trong nguyên liệu và trong trà thành phẩm bằng cách tách chiết trong dung môi là nước theo quy trình được mô tả trong Phụ lục 1 (mục 1.2.7) và điện di trên SDS-PAGE 10%, được mô tả trong phần phương pháp nghiên cứu. Kết quả được thể hiện trong hình 3.13.
Hình 3.13. Kết quả điện di polysaccharide tách chiết từ nấm vân chi
Ghi chú: M, thang chuẩn khối lượng protein (SM0671, Fermentas); cột 1, 2, 3: albumin của bò với hàm lượng lần lượt là 250 ng, 500 ng và 1000 ng; cột 4, 5: dịch chiết từ nấm tươi nguyên liệu; cột 6, 7: dịch chiết từ nấm sau sấy khô; cột 8, 9: dịch chiết từ trà thành phẩm.
Kết quả trên cho thấy, lượng PSP/PSK trong nấm tươi nguyên liệu không xuất hiện bang màu chứng tỏ hàm lượng các chất này có rất ít. Trong khi đó, vệt màu xuất hiện ở các mẫu nấm vân chi sấy khô và trong trà thành phẩm ở vị trí tương đương khoảng 100 KDa. Vệt màu ở cột 6, 7 xuất hiện đậm do hàm lượng PSP/PSK trong nấm sau sấy cao hơn so với trong mẫu trà thành phẩm.
Song song với đó, tôi cũng đã xác định nồng độ protein tổng số tách chiết được bằng phương pháp Bradford với kết quả như trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Hàm lượng protein tổng số xác định bằng phương pháp Bradford
Mẫu OD595 Nồng độ protein (ng/µL) Hàm lượng protein (% khối lượng) M1 0.298 32,200 0,644 M2 0.581 119,800 3,386 M3 0.471 79,300 2,196 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 70 100 55 40 35 25 kDa
Kết quả phân tích Bradford cho thấy, khi đo OD ở bước sóng 595 nm, nồng độ protein tổng số trong dịch chiết của mẫu M1, M2 và M3 lần lượt là 32,2, 119,8 và 79,3 ng/µL dịch chiết và hàm lượng protein trong nấm vân chi nguyên liệu, nấm sấy khô và trà vân chi thành phẩm khi quy đổi sang khối lượng ở các mức tương ứng là 0,644%, 3,386% và 2,196%.
3.8. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT TRÀ TÚI LỌC NẤM VÂN CHI
Hình 3.14. Quy trình công nghệ sản xuất trà túi lọc vân chi
Cỏ ngọt sấy khô (w ≤10%) Trà khô (w ≤10%) Nấm vân chi Túi lọc Phối trộn
(vân chi: trà nguyên liệu: cỏ ngọt 1: 0,3: 0,11) Sấy lần 2 (65oC, 30 phút) Làm nguội (25 - 30oC) Đóng bao 2g/túi Đóng gói 10 túi/hộp Sấy lần 1 ( 65oC, 180 phút) Xay, nghiền Vỏ hộp Sản phẩm Rửa sạch, để ráo nước
Thuyết minh quy trình
➢ Nguyên liệu
Nguyên liệu nấm vân chi sau khi thu hái, vận chuyển về phải đảm bảo chất lượng tốt, không bị bầm dập, không hư hỏng, kích thước đồng đều, không non quá cũng không quá già, thu hoạch từ 3 - 3,5 tháng kể từ lúc cấy giống.
Trước khi chế biến nấm được tiến hành rửa để loại bỏ lớp bụi bẩn bám trên bề mặt nấm và một lượng nhỏ vi sinh vật. Sau khi rửa để cho ráo nước nhằm làm giảm hàm lượng nước trong nấm sau khi rửa, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sấy, góp phần tăng chất lượng của sản phẩm. Các nguyên liệu phụ (trà, cỏ ngọt) được sấy khô về độ ẩm ≤10%.
➢ Sấy lần 1
Sau khi rửa và để ráo, nấm được đặt trên các khay trong tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 65oC trong thời gian 3 giờ, đưa độ ẩm của nấm về ≤10%. Trong thời gian sấy, dưới tác dụng của nhiệt độ sẽ đình chỉ một số hoạt động của enzyme, tiêu diệt vi sinh vật, làm tăng hàm lượng chất khô, giảm lượng ẩm có trong nấm để đảm bảo chất lượng của sản phẩm trong quá trình bảo quản.
Thời gian và nhiệt độ sấy cao hay thấp đều ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm. Nếu nhiệt độ thấp thì kéo dài thời gian sấy làm tổn thất nhiệt lượng trong quá trình sấy kéo quá trình tổn thất kinh tế, nhưng nếu thời gian sấy ngắn làm cho lượng ẩm không đạt tiêu chuẩn, sản phẩm dễ hút ẩm trở lại. Nếu nhiệt độ sấy quá cao sẽ rút ngắn được thời gian sấy tuy nhiên có thể làm mất đi một số hoạt chất có giá trị, sản phẩm bị cháy khét.
➢ Xay, nghiền
Xay, nghiền nhằm mục đích làm nhỏ kích thước của nấm vân chi cũng như trà nguyên liệu và cỏ ngọt để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly các chất. Do nấm vân chi có cấu trúc chủ yếu là dạng sợi và hàm lượng cellulose khá cao nên khi xay nghiền ra không ở dạng bột mà ở dạng các sợi bông nhỏ.
➢ Sấy lần 2
Tại công đoạn này tiến hành sấy ở 65oC trong thời gian 30 phút. Mục đích của công đoạn này là loại bỏ lượng ẩm thẩm thấu vào nguyên liệu trong quá trình xay nghiền nhằm đảm bảo độ ẩm đồng đều của nguyên liệu trước khi phối trộn (≤10%.)
➢ Phối trộn
Nấm vân chi có mùi hăng khó chịu, màu và vị không rõ ràng nên khi chế biến thành trà ta cần phối hợp với trà nguyên liệu và cỏ ngọt để tạo ra vị hài hòa, mùi thơm
và màu sắc đẹp hơn. Cỏ ngọt và trà nghiên liệu đã được sấy khô, xay nghiền phối trộn với vân chi theo tỷ lệ nấm vân chi: trà nguyên liệu:cỏ ngọt là 1:0,3:0,11.
➢ Đóng bao, đóng gói
Sau quá trình phối trộn, hỗn hợp được để nguội về nhiệt độ môi trường sau đó tiến hành đóng gói, tránh đóng gói khi còn nóng sẽ dẫn đến hiện tượng ẩm ngưng tụ làm hỏng sản phẩm. Bột trà sẽ được đưa vào trong các túi lọc được làm từ các loại giấy không tan trong nước nóng, trích ly được các chất hòa tan trong trà (theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7975 : 2008), định lượng 2g trà/túi.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
* KẾT LUẬN
Qua quá trình nghiên cứu tôi đưa ra một số kết luận sau:
- Thành phần hóa học của nấm nấm vân chi nuôi trồng tại Khoa Nông học, trường Đại học Nông Lâm Huế đã được phân tích với các hàm lượng tương ứng là: độ tro: 3,51%; protein: 11,60%; lipid: 0,56%; đường khử: 7,16% ; cellulose: 41,01%; PSP thô: 2,80%; PSK thô: 2,11%.
- Chế độ sấy thích hợp để sấy nâm vân chi đạt độ ẩm yêu cầu cho chế biến trà túi lọc nấm vân chi là sấy ở 65oC trong 3 giờ, sau đó sấy ở 65oC trong 30 phút.
- Tỷ lệ phối trộn nguyên liệu phụ thích hợp là nấm vân chi : trà nguyên liệu : cỏ ngọt theo tỷ lệ 1:0,3:0,11.
- Một số chỉ tiêu của sản phẩm đã được phân tích gồm: độ tro: 4,91%; protein: 13,34%; lipid: 1,24%; đường khử: 7,29% ; cellulose: 37,37%; PSP thô: 1,92%; PSK thô: 1,45%. Sản phẩm đạt yêu cầu về chỉ tiêu vi sinh theo TCVN 7975 : 2008.
* KIẾN NGHỊ
- Xác định lượng hoạt chất PSP, PSK trong nấm vân chi nguyên liệu và thành phẩm bằng các phương pháp chính xác hơn như GC-MS, HPLC.
- Phối trộn nguyên liệu phụ và đánh giá mức độ ưa thích ở quy mô lớn với các đối tượng thường xuyên sử dụng trà làm thức uống để có kết quả chính xác hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1. Kiều Hữu Ảnh (2010), Vi sinh học thực phẩm, Nhà xuất bản giáo dục.
2. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Tập, phan Văn Hiển (2006), Cây thuốc và động vật làm dược liệu ở Việt Nam, Viện dược học, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội.
3. Trương Thị Mỹ Chi (2009), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa và tác dụng
theo hướng tăng cường miễn dịch thực nghiệm của một số loài nấm, Luận văn
thạc sỹ, Đại học quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
4. Vũ Văn Chuyên (1970), Thực vật học, Nhà xuất bản Y học và thể dục thể thao, ed, Vol. tập 1, Hà Nội.
5. Nguyễn Lân Dũng (2002), Công nghệ nuôi trồng nấm, Tái bản lần thứ nhất, Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.
6. Quách Đĩnh, Nguyễn Văn Tiếp và Nguyễn Văn Thoa (2008), Công nghệ chế biến rau quả, Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
7. Nguyễn Văn Hiếu (2014), Tách chiết và xác định cấu trúc một số hợp chất Trerpenoid từ nấm vân chi (Trametes cubesis ( mont.) sacc.) ở Nghệ An. Luận
văn thạc sỹ. Trường đại học Vinh.
8. Tôn Nữ Liên Hương, Võ Hoàng Duy và Dương Mộng Hòa (2015), Chiết xuất Steviosied từ cây cỏ ngọt, Nhà xuất bản Tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ.
9. Trịnh Tam Kiệt, Võ Văn Chi, Trần Đình Nghĩa (1983 ), Thực tập phân loại thực
vật-thực vật bậc thấp, Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội.
10. Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong và Nguyễn Thị Làn (2014), Xác định thành
phần dinh dưỡng của lá cỏ ngọt Việt Nam, Nhà xuất bản Tạp chí khoa học và
phát triển.
11. Vũ Thục Linh (2015), Báo cáo thị trường chè EU, Cục xúc tiến thương mại. 12. Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản y học
Hà Nội.
13. Vũ Tuấn Minh, Lê Thị Thu Hường (2017), Nghiên cứu sự sinh trưởng, phát triển
và năng suất nấm Vân Chi ( Trametes versicolor (l) pilat) trồng trên các loại giá thể tại Thừa Thiên Huế 2017.
14. Nguyễn Thị Ngần (2015), Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả
chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ, Luận án tiến sỹ,
Trường Đại học Vinh.
15. Nguyễn Thị Bích Thùy (2014), Nghiên cứu đặc điểm sinh học và công nghệ nuôi
trồng nấm sò vua và nấm vân chi ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ, Viện khoa học
nông nghiệp Việt Nam.
16. Lê xuân Thám, Trần Hữu Độ và Tamikazu (1999), Bổ sung vào nhóm nấm chống
ung thư ở Việt Nam: nấm vân chi trametes versicolor( L.:Fr) Pilats, Tạp chí
dược học, số 2.
17. Hồ Sỹ Tráng (2004), Cơ sở hóa học gỗ và cellulose. Vol. tập 2, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội.
18. Cổ Đức Trọng, (2002), Nấm vân chi một vị thuốc quý cần chú ý, Tạp chí thuốc và sức khỏe, Nhà xuất bản khoa học TP. Hồ Chí Minh.
19. Hà Duyên Tư, (2006), Kỹ Thuật phân tích cảm quan thực phẩm, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật Hà Nội.
20. Nguyễn Phương Uyên (2005). Khảo sát sinh trưởng một số chủng nấm vân chi đen (Trametes versicolor) có nguồn gốc từ Trung Quốc. Khóa luận tốt nghiệp,
Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
21. Đào Thanh Vân, Đặng Thị Tố Nga (2007), Giáo trình cây hoa, Nhà xuất bản
Nông nghiệp Hà Nội.
22. Lê Thị Tuyết Vân (2004), Tiêu chuẩn hoá nấm Vân chi Trametes versicolor (L.:Fr) Pilátt, Coriolus vesicolor (L.: Fr) Quél, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ
Dược học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng anh
23. Bitasta. M và Swati. M. (2011), Comparative Standardization and Physicoche- mical Evaluation of the Leaves of Stevia rebaudiana Bertoni from Different Geographical Sources, Pharmacognosy Journal, 3(25), tr. 21-26.
24. Cheng. KF và Leung. PC (2008). General review of polysaccharope- ptides
(PSP) from C. versicolor: Pharmacological and clinical studies. Cancer Ther. 6,
tr. 117-130.
25. Cui. J, Chisti. Y. (2003), Polysaccharopeptides of Coriolus versicolor: physiological activity, uses, and production. Biotechnology Advances, 21(2), tr.
109-122.
26. Duvnjak. D, Milena Pantić, Vladimir Pavlović, Viktor Nedović, Steva Lević, Danka Matijašević, Aleksandra Sknepnek, Miomir Nikšić. (2016), Advances in
batch culture fermented Coriolus versicolor medicinal mushroom for the production of antibac- terial compounds. Innovative Food Science & Emerging
Technologies, 34, tr. 1-8.
27. Esmat Abou-Arap. A, Azza Abou-Arap. A và Ferial Abu-Salem. M. (2010).
Physico-chemical assessment of natural sweeters steviosides produced from Stevia rebaudiana bertoni plant . African Journal of food Science.
28. Fisher. M, Yang. LX. (2002), Anticancer effects and mechanisms of polysaccharide-k
(psk): implications of cancer immunotherapy, Anticancer Res 2002.
29. Hayakawa. K Mitsuhashi N, Saito Y, Nakayama Y, Furuta M, Nakamoto S, Kawashima M, Niibe H. (1997), Effect of krestin as adjuvant treatment following radical radiotherapy in nonsmall cell lung cancer patients, Cancer Detect Prev. 30. Jakub Kowalczewska. MPiotrowski, Jędrzejewski. T và Kozak. W. (2016),
Polysaccharide peptides from Coriolus versicolor exert differential im- munomodulatory effects on blood lymphocytes and breast cancer cell line MCF- 7 in vitro, Immunology Letters, 174, tr. 37-44.
31. Lee. CL, Yang. X và Wan. JM, (2006). The culture duration affects the immunomodulatory and anticancer effect of polysaccharopeptide derived from Coriolus versicolor. Enzyme Microb Tech. 38, tr. 14-21.
32. Ng, Tzibun. (1998), A review of research on the protein-bound polysaccha-ride (polysaccharopeptide, PSP) from the mushroom Coriolus versicolor (basidiomycetes: Polyporaceae), General Pharmacology: The Vascular System. 30(1), tr. 1-4.
33. Oba. K. (2007), Efficacy of adjuvant immunochemotherapy with polysac-charide k for patients with curative resections of gastric cancer, Cancer Immunol Immunother.
34. Rosendahl. Ann H, Chen Sun, DeQuan Wu, Roland Andersson. (2012), Polysaccharide-K (PSK) inc- reases p21WAF/Cip1 and promotes apoptosis in pancreatic cancer cells. Pancreatology, 12(6), tr. 467-474.
35. Sliva. D. (2003), Ganoderma lucidum in cancer treatment, Integr cancer ther. 36. Tzianabos. AO.(2000), Polysaccharide Immunomodulators as Therape utic
Agents: Structural Aspects and Biologic Function, Clin Microbiol Rev, 13(4), tr. 523-533.
37. Wen-kuang. Hsu, Tai-hao. Hsu và Fang-yi. Lin. (2013), Separation, purific- ation, and α-glucosidase inhibition of polysaccharides from Coriolus versicolor LH1 mycelia, Carbohydrate Polymers. 92(1), tr. 297-306.
38. Yang QY. (2010) , Yunzhi polysaccharide psp and the general aspects of its reseach, Dept of Biol of Shanghai Teachers University.
39. Yang. MMP, Chen. Z và Kwok. JSL. (1992), The antitumor effect of a small polypeptide from Coriolus versicolor (SPCV), Cancer Ther.
40. Yi-Fang. Li, Ouyang SH, Chang YQ, Wang TM, Li WX, Tian HY, Cao H, Kurihara H, He RR. (2017), A comparative analysis of chemical compositions in Camellia sinensis var. puanensis Kurihara, a novel Chinese tea, by HPLC and UFLC-Q-TOF-MS/MS, Food Chemistry, 216, tr. 282-288.
41. Zjalic. S, Massimo Reverberi, Alessandra Ricelli, Vito Mario Granito, Corrado Fanelli, Anna Adele Fabbri. (2006), Trametes versicolor: A possible tool for aflatoxin control, International Journal of Food Microbiology. 107(3), tr. 243-249.
PHỤ LỤC 1
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA NGUYÊN LIỆU VÀ THÀNH PHẨM
1.1. PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ
1.1.1. Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi
Lấy hộp nhôm sạch đem sấy ở 100 - 105oC cho đến khối lượng không đổi. Để nguội ở trong bình hút ẩm và đem cân ở cân phân tích có độ chính xác là 0,01 g. Sau đó cho vào hộp nhôm 3/5 khối lượng nguyên liệu nghiền nhỏ hoặc trà đã chuẩn bị sẵn. Cân tất cả ở cân phân tích rồi cho vào tủ sấy ở 100 - 105 oC cho đến khối lượng không đổi. Sau khi sấy xong để nguội trong bình hút ẩm rồi đem đi cân. Tiếp tục cho lại vào tủ sấy với nhiệt độ như trên trong vòng 30 phút sau đó để nguội trong bình hút ẩm rồi đem đi cân. Kết quả 2 lần cân liên tiếp không quá 0,01 g .
1.1.2. Xác định hàm lượng tro
Cân 5g mẫu khô vào chén nung đã biết trước khối lượng, đậy nắp lại rồi cho vào lò đốt nhiệt độ 53 - 55oC. Mẫu cháy hoàn toàn cho đến khi biến thành màu trắng xám. Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân.
1.2. PHƯƠNG PHÁP HÓA SINH
1.2.1. Xác định đường khử bằng phương pháp Bertrand
- Cân 1g mẫu đã nghiền nhỏ cho bình tam giác 250 ml thêm 25 ml HCl 5%, đun cách thủy trong 30 phút rồi làm nguội dưới vòi nước chảy, trung hòa acid trên bằng NaOH 30%, cho đến khi dung dịch xuất hiện màu hồng với chỉ thị 3 giọt phenolphthalein.
- Để loại tạp chất ta thêm thêm 7 ml chì acetat 30% vào dịch chiết ở trên rồi chuyển sang bình định mức 100 ml, lắc đều. Để lắng 5 phút sẽ xuất hiện lớp chất lỏng trong phía trên và phần cặn ở dưới.
- Cho vào 15 - 20 ml Na2SO4 bảo hòa để loại chì acetat dư, lắc đều và để lắng xuống. Thêm nước cất vừa đủ 100ml, lắc đều và lọc qua giấy lọc.
- Cho vào bình tam giác dung tích 250 ml: 25 ml Fehling và 20 ml Fehling B, cho 10 ml dịch đường trong vào. Đun sôi trên bếp điện 2 phút cho đến khi có kết tủa