2.3.1 Các chất gây độc gan
Trong thực nghiệm sàng lọc các hợp chất cĩ khả năng bảo vệ gan, các hĩa chất gây nhiễm độc gan trong các mơ hình thử nghiệm trên động vật thường được sử dụng là carbon tetrachloride (CCl4) và paracetamol (acetaminophen).
2.3.1.1 Carbon tetrachloride
Carbon tetrachloride (CCl4) là dung mơi hữu cơ được sử dụng rộng rãi trong ngành cơng nghiệp hĩa chất. Sự nhiễm độc gan do CCl4 gây ra gan nhiễm mỡ và hoại tử gan (Masuda, 2006; Quan et al., 2009). CCl4 gây tổn thương tế bào gan làm tăng nồng độ các enzyme aspartat transaminase (AST), alanin transaminase (ALT) và cholesterol trong huyết thanh. Đây là các enzyme được tạo ra trong tế bào gan và phĩng thích vào hệ tuần hồn khi tế bào gan bị tổn thương. CCl4 cũng đĩng một vai trị quan trọng trong sự tích tụ triacylglycerol, làm suy giảm GSH, làm giảm sự tổng hợp protein và mất hoạt tính các enzyme (Recknagel et al., 1989). CCl4 được hoạt hĩa bởi
cytochrome P-450 phụ thuộc oxy ở lưới nội chất tạo thành gốc tự do trichloromethyl (CCl3•) và Cl3COO•. Các gốc này kết hợp với các đại phân tử quan trọng trong tế bào như lipid và protein trong điều kiện cĩ oxy tạo ra sự peroxide hĩa lipid (Snyder and Andrews, 1996). Một số sản phẩm peroxide hĩa lipid là các aldehyde phản ứng, cĩ thể hình thành các sản phẩm kết hợp với protein dẫn đến những thay đổi trong cấu trúc của lưới nội chất và các màng khác, làm tăng tính thấm của màng tế bào đối với Ca2+
gây rối loạn nghiêm trọng sự cân bằng canxi và gây ra sự chết tế bào do hoại tử (Weber et al., 2003). Vì vậy, peroxide hĩa lipid được coi là một yếu tố quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của tổn thương gan do CCl4. Việc ức chế hình thành các gốc tự do được xem là điểm mấu chốt trong việc bảo vệ chống lại tổn thương do CCl4 gây ra. Do đĩ, mơ hình này được sử dụng rộng rãi để đánh giá dược phẩm và các sản phẩm tự nhiên cĩ hoạt tính bảo vệ gan và kháng oxy hĩa (Delgado-Montemayor et al., 2015). Trong thực nghiệm gây độc gan bằng CCl4, cĩ các mơ hình gây bệnh khác nhau. Liều duy nhất của CCl4 cĩ thể đạt nồng độ đỉnh trong 3 giờ. Trong vịng 24 giờ, CCl4 gây ra thay đổi các chỉ số sinh hĩa và mơ học của tế bào gan. Sử dụng liều lặp lại CCl4 cĩ thể gây xơ hĩa và hoại tử gan. Tiêm dưới da CCl4 liều 2 ml/kg trong 2 ngày làm tăng hàm lượng AST và ALT, nếu tiếp tục trong 2-4 tuần sẽ dẫn đến xơ hĩa và xơ hĩa tiến triển trong 5-7 tuần, xơ gan nặng trong 8-9 tuần (Iqubal et al., 2016).
2.3.1.2 Paracetamol
Paracetamol (acetaminophen) là một loại thuốc hạ sốt và giảm đau phổ biến. Các liều điều trị paracetamol là an tồn, tuy nhiên, liều gây độc cĩ thể làm hoại tử gan gây tử vong ở người và chuột. Paracetamol được thải trừ như sulfat và glucoronide khi dùng ở liều điều trị thơng thường và chỉ cĩ 5% liều được chuyển thành N-acetyl-p- benzoquineimine (NAPQI) (Eriksson et al., 1992). Tuy nhiên, khi sử dụng các liều độc paracetamol, các con đường sulfate hĩa và glucoronide hĩa trở nên bão hịa. Do đĩ, cĩ nhiều phân tử paracetamol bị oxy hĩa thành NAPQI phản ứng cao bởi các enzyme cytochrome P-450. Các gốc semiquinone tạo ra do khử một electron của NAPQI, cĩ thời gian bán hủy rất ngắn và nhanh chĩng kết hợp với glutathione (GSH) làm suy giảm nguồn GSH của gan (Remirez et al., 1995). Sự hình thành NAPQI dư thừa hoặc giảm tích trữ glutathione dẫn đến NAPQI liên kết với các protein và lớp lipid kép của màng tế bào gan làm tăng peroxide hĩa lipid. Kết quả là sự chết tế bào gan và hoại tử gan (McConnachie et al., 2007). Tổn thương gan do paracetamol quá liều, các chức năng vận chuyển của các tế bào gan bị rối loạn dẫn đến rị rỉ của màng sinh chất, gây ra sự gia tăng nồng độ các enzyme AST và ALT trong huyết thanh.
2.3.2 Stress oxy hĩa ảnh hưởng đến chức năng gan
Gan cĩ vai trị quan trọng trong duy trì và điều hịa cân bằng nội mơi của cơ thể. Gan cũng là cơ quan chính bị tấn cơng bởi ROS (Sanchez-Valle et al., 2012). Các tế bào nhu mơ là những tế bào đầu tiên bị stress oxy hĩa tấn cơng gây ra tổn thương ở
gan. Các ty thể, microsomes và peroxisome trong các tế bào nhu mơ cĩ thể sản xuất ROS. Ở động vật cĩ vú, hệ thống kháng oxy hĩa đã phát triển hồn chỉnh để duy trì trạng thái cân bằng oxy hĩa khử trong gan (Hình 2.5). Khi ROS quá nhiều, trạng thái cân bằng sẽ bị xáo trộn, dẫn đến stress oxy hĩa là nguyên nhân chính trong các bệnh gan và các rối loạn thối hĩa và mãn tính khác (Li et al., 2014). Stress oxy hĩa khơng chỉ gây thiệt hại gan do gây thay đổi thành phần lipid, protein và DNA và quan trọng hơn cịn điều hịa các con đường kiểm sốt các chức năng sinh học khác.
Hình 2.5: Trạng thái cân bằng oxy hĩa – khử trong gan (Li et al., 2015)
2.3.2.1 Stress oxy hĩa gây ra do rượu
Bệnh gan do rượu (Alcohol Liver Disease) là một trong những nguyên nhân quan trọng nhất gây tử vong liên quan gan, cĩ liên quan với lượng rượu và thời gian uống rượu. Bệnh gan do rượu cĩ thể tiến triển từ nhiễm mỡ gan đến bệnh gan nặng hơn như viêm gan, xơ gan (Gao and Bataller, 2011; Banerjee et al., 2013).
Con đường đầu tiên chuyển hĩa rượu là hệ thống dehydrogenase, được xúc tác bởi alcohol dehydrogenase (ADH), co-enzyme NAD+ cần thiết oxy hĩa rượu thành acetaldehyde biểu hiện ở mức độ cao trong tế bào gan. Sau đĩ, acetaldehyde vào các ty thể, được oxy hĩa thành acetate bởi aldehyde dehydrogenase (ALDH). Con đường thứ hai để oxy hĩa rượu là hệ thống oxy hố microsomal ethanol (MEOS), bao gồm enzyme NADPH, cytochrome-P450, enzyme CYP2E1. Con đường MEOS được cảm ứng ở người nghiện rượu. Ngồi ra, rượu cĩ thể cũng bị oxy hĩa bởi catalase trong peroxisome, quá trình oxy hĩa này cần cĩ sự hiện diện hydrogen peroxide (H2O2) (Dey and Lakshmanan, 2013). Trong quá trình trao đổi chất thơng qua hệ thống dehydrogenase và hệ thống MEOS, NADH hoặc NADP+ sẽ được sản xuất với số lượng lớn, dẫn đến sự gia tăng của ROS, gây stress oxy hĩa dẫn đến tổn thương tế bào gan, và cuối cùng gây ra các bệnh gan khác nhau (Hình 2.6).
Hình 2.6: Cơ chế dẫn đến bệnh gan do rượu (Li et al., 2015)
2.3.2.2 Stress oxy hĩa gây ra do thuốc
Gan là cơ quan mục tiêu của các độc chất từ thuốc. Sự sản xuất các dịng oxy hoạt động, cụ thể ROS và RNS, được xem như là sự kiện đầu tiên của độc tố gan do thuốc và như một chỉ số về khả năng gây độc gan (Videla, 2009). Cĩ rất nhiều thuốc cĩ thể gây ra stress oxy hĩa bao gồm tăng oxy hĩa tế bào và peroxide hĩa lipid, làm suy giảm các chất kháng oxy hĩa trong gan, chẳng hạn như thuốc kháng viêm, thuốc giảm đau, thuốc kháng ung thư và thuốc kháng trầm cảm. Sulfasalazine là thuốc dùng điều trị bệnh viêm đường ruột gây ra tổn thương oxy hĩa ở gan (Linares et al., 2009), acid zoledronic điều trị bệnh liên quan ung thư cĩ thể gây ra stress oxy hĩa và giảm chất kháng oxy hĩa trong gan (Karabulut et al., 2010).
2.3.2.3 Stress oxy hĩa gây ra do độc chất mơi trường
Các chất gây ơ nhiễm mơi trường như các kim loại nặng và microcystin đã được chứng minh gây ra tổn hại oxy hĩa ở gan, trong các mơ hình thử nghiệm trên động vật. Hệ thống bảo vệ kháng oxy hĩa trong gan chuột lang bị tổn thương sau khi xử lý với thủy ngân (Bando et al., 2005). Bên cạnh thủy ngân, chì cũng được phát hiện gây tăng sự peroxide hĩa lipid ở gan chuột. Nghiên cứu cũng cho thấy việc tạo ra các gốc tự do là cơ chế phát sinh bệnh lý của độc chất gan chì (Adegbesan and Adenuga, 2007). Microcystin, độc tố sản xuất bởi vi khuẩn lam cĩ trong nước cĩ dạng peptide vịng, là độc chất cĩ thể gây ra tổn thương nghiêm trọng cho gan (Moreno et al., 2005).
2.4 Các dạng tổn thương gan 2.4.1 Bệnh gan nhiễm mỡ 2.4.1 Bệnh gan nhiễm mỡ
Gan nhiễm mỡ là đặc điểm chung của bệnh gan nhiễm mỡ khơng do rượu từ giai đoạn sớm, tiến triển đến viêm gan nhiễm mỡ khơng do rượu, dẫn đến xơ hĩa gan. Mỡ gan gây stress tế bào và viêm trực tiếp đến tế bào gan và các tế bào khơng phải nhu mơ bao quanh. Stress oxy hĩa chịu trách nhiệm cho sự khởi phát viêm hoại tử. Sự phát sinh các dịng oxy phản ứng (ROS) trong quá trình chuyển hĩa acid béo tự do trong microsomes, peroxisome và ty thể là nguồn tạo nên stress oxy hĩa (Pessayre, 2007). Hoạt động oxy hĩa bên trong ty thể là nguyên nhân chính sản sinh ra ROS trong tế bào, do đĩ rối loạn chức năng ty thể đĩng vai trị trung tâm trong sự tiến triển của viêm gan nhiễm mỡ khơng do rượu.
Các phản ứng miễn dịch cũng đĩng gĩp một phần gây viêm gan ở viêm gan nhiễm mỡ khơng do rượu. Ngay cả trong gan nhiễm mỡ, một số loại tế bào viêm cĩ mặt, và chúng được cho là cĩ ảnh hưởng đến sự tiến triển của gan nhiễm mỡ thành bệnh viêm gan nhiễm mỡ.
2.4.2 Bệnh gan mạn tính
Bệnh gan mạn tính (Chronic liver disease) được định nghĩa là bệnh cĩ bằng chứng rối loạn chức năng gan liên tục cả về lâm sàng và sinh hĩa kéo dài hơn 6 tháng (Nawar et al., 2011). Bệnh gan mạn tính là một tình trạng bệnh liên quan đến quá trình phá hủy và thối hĩa khơng ngừng mơ gan dẫn đến xơ hĩa gan và xơ gan. Ở gan bình thường, sự tạo sợi (fibrogenesis) và phân hủy sợi (fibrolysis) của mơ gan ở trạng thái cân bằng, xơ hĩa chỉ xảy ra khi mơ sẹo tích tụ quá mức và nhanh hơn quá trình bị phân hủy. Sự tạo thành mơ sẹo là đáp ứng bình thường của cơ thể đối với tổn thương, nhưng trong xơ hĩa gan quá trình làm lành mơ sẹo bị ức chế hoặc khơng xảy ra. Xơ hĩa gan là tình trạng tích tụ chất nền ngoại bào trong gan, là hậu quả của đáp ứng làm lành tổn thương gan trước những tổn thương lập đi lập lại liên tục do các nguyên nhân khác nhau bao gồm viêm gan do virus, bệnh tự miễn, thuốc, rượu, bệnh về đường mật, rối loạn chuyển hĩa và miễn dịch (Pinzani et al., 2005). Xơ hĩa gan thường khởi phát âm thầm, và hầu như các bệnh liên quan và tử vong xảy ra sau khi xơ gan đã phát triển. Phần lớn những bệnh nhân thường tiến triển đến xơ gan sau một khoảng thời gian dài 15-20 năm. Các thành phần của mơ sẹo trong xơ gan gồm các thành phần chất nền ngoại bào (ECM), collagene type I và III, muối sulfate proteoglycan và glycoprotein.
2.4.3 Xơ hĩa gan và xơ gan
Xơ hĩa gan là hậu quả của đáp ứng làm lành tổn thương gan trước những tổn thương lập đi lập lại liên tục. Xơ hĩa gan cĩ thể được định nghĩa là kết quả của việc tích lũy chất nền ngoại bào (ECM) tiến triển và giảm sự tái kiến trúc chất nền ngoại
bào, làm gián đoạn kiến trúc bình thường của gan (Iredale, 2007). Nếu khơng được điều trị, xơ hĩa cĩ thể tiến triển thành xơ gan, cuối cùng dẫn đến suy gan và tử vong.
Ở gan bình thường, các tế bào gan được bao phủ bởi lớp nội bì cĩ các khe. Tế bào Kupffer là đại thực bào nằm trong lịng xoang gan, sát thành lớp nội bì. Tế bào sao nằm trong các khoảng Disse, khe giữa tế bào nội bì và tế bào gan (Hình 2.7A). Khi gan bị tổn thương, xảy ra sự xâm nhiễm tế bào lympho viêm vào mơ gan, một số tế bào gan chết theo chương trình. Tế bào Kupffer được hoạt hĩa phĩng thích hĩa chất trung gian tạo sợi. Tế bào sao tăng sinh và tạo ra một lượng lớn protein chất nền ngoại bào. Quá trình này làm mất vi nhung mao tế bào gan và làm biến mất các khe giữa các tế bào nội bì xoang gan, sự co thắt các tế bào sao gây tăng đề kháng với dịng máu trong xoang gan (Hình 2.7B). Khi gan bị tổn thương liên tục, chất nền tỉ trọng thấp (low-density ECM) trở thành mơ “giống sẹo” và chức năng tế bào gan suy giảm (Friedman, 2003).
Hình 2.7: Sự thay đổi cấu trúc khi gan bị tổn thương.
A Cấu trúc xoang gan bình thường. B Những thay đổi khi tế bào gan bị tổn thương mạn tính (Ramon and Brenner, 2005).
Xơ hĩa mơ gan được đặc trưng bởi sự lắng đọng quá mức chất nền ngoại bào, liên quan đến sự tái sắp xếp của các loại collagen, proteoglycan, glycoprotein và hyaluronate. Sau sự tổn thương gan cấp, như viêm gan do virus, cĩ hiện tượng tái tạo tế bào mơ gan để thay thế cho các tế bào hoại tử và các tế bào chết theo chương trình. Quá trình này liên quan đến đáp ứng viêm và sự tích tụ chất nền ngoại bào. Nếu tổn thương gan vẫn tiếp diễn và sự tái tạo gan thất bại, thì các tế bào gan đuợc thay thế bằng chất nền ngoại bào và các sợi collagen. Sự phân bố của các chất sợi tùy thuộc vào nguồn gốc của tổn thương gan.
Các nghiên cứu về xơ hĩa gan cho thấy tế bào sao đĩng vai trị chủ yếu trong việc sản sinh collagen trong xơ gan. Khi tế bào sao ở trạng thái nghỉ, nĩ sản sinh ra một lượng nhỏ collagen type III và IV. Khi được hoạt hĩa, ngồi sản sinh ra chủ yếu collagen type I, chúng cịn tạo thêm collagen type III, IV, VI, fibronectin, acid hyaluronic và các protein khác. Xơ hĩa gan liên quan tới những thay đổi chủ yếu về số lượng và thành phần của chất nền ngoại bào. Ở giai đoạn tiến triển, lượng chất nền ngoại bào quanh tế bào gan nhiều gấp 6 lần lúc bình thường, gồm các sợi collagen (loại I, III và V), fibronectin, undulin, elastin, laminin, hyaluronan, và proteoglycan. Tế bào sao là tế bào chính sản xuất chất nền ngoại bào ở gan bị tổn thương. Ở gan lành, tế bào sao tập trung ở khoảng cửa và là nơi dự trữ chính của vitamin A. Khi gan bị tổn thương mạn tính, tế bào sao được hoạt hĩa hoặc chuyển thành dạng giống nguyên bào sợi, cĩ khả năng co rút, phát tín hiệu viêm và cĩ đặc tính gây hĩa xơ. Những tế bào sao hoạt hĩa sẽ di chuyển và tích tụ ở những vùng mơ cần sửa chữa, tiết ra một lượng lớn chất nền ngoại bào và điều hịa sự phân hủy chất này (Gressner et al., 2009).
Tế bào sao trong gan là các tế bào cư trú quanh xoang gan phân bố khắp gan, với các chức năng quan trọng trong gan bình thường và tổn thương gan. Ở gan bình thường, tế bào sao tham gia vào quá trình dự trữ retinoid, điều hịa mạch máu qua sự tương tác với tế bào nội bì, cân bằng nội mơi chất nền ngoại bào, khử độc thuốc, điều hịa miễn dịch, và cĩ thể bảo tồn sinh khối tế bào gan thơng qua sự tiết các tác nhân gây phân chia tế bào (mitogen) bao gồm các yếu tố tăng trưởng tế bào gan. Trong tổn thương gan, tế bào sao hoạt hĩa biến đổi thành các nguyên bào sợi co rút (myofibroblasts), gĩp phần làm làm méo mĩ mạch và tăng sự đề kháng mạch gây tăng áp lực khoảng cửa.
2.5 Một số loại thuốc bảo vệ gan
Việc sử dụng thuốc hay thực phẩm chức năng để hỗ trợ và bảo vệ gan ngày càng phổ biến. Cĩ nhiều loại thuốc bảo vệ gan đã được nghiên cứu và sử dụng trong điều trị các bệnh về gan, đặc biệt cĩ một số loại thuốc hoặc thực phẩm chức năng bảo vệ gan cĩ nguồn gốc thảo dược như Legalon (silymarin), Abivina (Bồ bồ), Dihacharin (Diệp hạ châu đắng), Hana (Cà gai leo), Hepatis (Kim ngân hoa, Thổ phục sinh, Cà gai leo, Khúng khéng), Boganic (Actiso, Rau đắng đất, Bìm bìm), Livolin-H (Phospholipid Đậu nành), Avigly (Glycyrrhizine Cam thảo), Liv 52.
Các thuốc hoặc thực phẩm chức năng bảo vệ gan giúp duy trì sự ổn định của tế bào gan, làm cho tế bào gan bền vững trước sự tấn cơng của các tác nhân gây bệnh. Để bảo vệ tế bào gan, các loại thuốc cĩ các tác dụng ngăn cản sự chuyển hĩa các thuốc khác hoặc hĩa chất khi vào cơ thể thành các chất độc với gan, làm sạch gốc tự do và kháng viêm, làm giảm peroxide hĩa bảo vệ màng tế bào, giúp tế bào tăng sức chống đỡ với các tác nhân gây bệnh (Shi et al., 2020).
2.6 Sơ lược về một số lồi thực vật thuộc họ cà phê
2.6.1 Sơ lược về cây Mơ lơng (Paederia lanuginosa Wall.)
Mơ lơng là lồi thực vật dây leo, sống nhiều năm. Thân cây cĩ màu xanh lục