Nghiên cứu chọn ra loại cao chiết (cao methanol) cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa và bảo vệ gan tốt để ly trích cao phân đoạn với các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần. Sau đĩ, các cao phân đoạn được định tính sơ bộ thành phần hĩa học, định lượng polyphenol và flavonoid, khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa và bảo vệ gan. Cao phân đoạn cĩ hoạt tính sinh học mạnh nhất sẽ được sử dụng để phân lập chất và xác định thành phần hĩa hĩa học.
3.2.7.1 Chiết xuất và điều chế cao phân đoạn
Mẫu nguyên liệu thực vật được xử lý và chiết cao như mơ tả trong trong mục 3.2.3 để thu được cao methanol tổng. Cao methanol tổng được hịa tan vào một lượng nước vừa đủ (loại bỏ phần khơng tan) thu được dung dịch lỏng. Sau đĩ, dung dịch này được chiết lần lượt với các dung mơi theo thứ tự độ phân cực tăng dần là n-hexane và ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng thu được các cao chiết phân đoạn tương ứng là n-hexane, ethyl acetate và cao nước. Hiệu suất ly trích các phân đoạn
được xác định dựa vào cơng thức sau:
3.2.7.2 Định tính và định lượng thành phần hĩa học trong cao methanol tổng và các cao phân đoạn
Các cao chiết phân đoạn được định tính sơ bộ một số thành phần hĩa học và định lượng thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng theo các phương pháp như trình bày ở mục 3.2.4.1.
3.2.7.3 Khảo sát khả năng kháng oxy hĩa, kháng viêm và bảo vệ gan của các cao phân đoạn
Khả năng kháng oxy hĩa, kháng viêm in vitro của các cao phân đoạn được khảo sát tương tự như trình bày trong các mục 3.2.4.2, 3.2.4.3 và hoạt tính bảo vệ gan trên mơ hình chuột của các cao phân đoạn được khảo sát tương tự như trình bày trong mục 3.2.5. Trong khảo sát này, hoạt tính bảo vệ gan của cao methanol tổng và các cao phân đoạn được khảo sát ở liều 200 mg/kg khối lượng chuột theo Sobeh et al. (2020), cũng là liều ở giữa của 3 liều (100, 200, 400 mg/kg) thử nghiệm bảo vệ gan của cao methanol, nhằm mục đích tìm ra phân đoạn cĩ hoạt tính bảo vệ gan tốt nhất tiến hành phân lập chất.
3.2.8 Phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc của các hợp chất từ cao chiết cĩ hoạt tính bảo vệ gan hiệu quả nhất
Phân lập và tinh chế các hợp chất bằng các phương pháp thường quy trong sắc ký cột cổ điển, bao gồm sắc ký nhanh cột khơ, sắc ký cột pha thường, kết hợp với sắc ký lớp mỏng và kết tinh lại.
Các chất tinh khiết được xác định những chỉ số hĩa lý đặc trưng như màu sắc, dạng tinh thể, Rf trên bản mỏng, khả năng hấp thụ quang phổ, khả năng hịa tan trong các loại dung mơi. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp quang phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (IR), phổ UV-Vis, đặc biệt là phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và khối phổ (MS).Các loại phổ được đo tại Viện Hĩa học-Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, số 18, Hồng Quốc Việt, quận Cầu Giấy, Hà Nội.
3.2.9 Xử lý số liệu
Các số liệu được tính và thể hiện dưới dạng số trung bình, số liệu được xử lý thống kê và phân tích Anova (Fisher’s) bằng phần mềm thống kê Minitab 16.0. Các biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Điều tra các loại cây dược liệu sử dụng trong điều trị bệnh gan
Nghiên cứu điều tra phỏng vấn về thành phần cây dược liệu được sử dụng làm thuốc điều trị các bệnh về gan đã thu thập được thơng tin của 50 lồi thuộc 22 họ thực vật, đều thuộc ngành Ngọc lan (Magnliophyta). Dựa trên kết quả điều tra, nghiên cứu đã thành lập được danh sách, sắp xếp theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009) với các thơng tin về tên Việt Nam, tên khoa học, bộ phận dùng, mục đích sử dụng của từng lồi cây được trình bày trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Các lồi cây dược liệu được sử dụng điều trị bệnh gan
TT Tên Việt Nam Tên khoa học Bộ phận dùng Mục đích sử dụng 1. Họ Ơ rơ Acanthaceae
1 Xuyên tâm liên Andrographis paniculata Tc, La 7
2 Ơ rơ Acanthus sp. Tc, La 7
3 Mãnh cọng Clinacanthus nutans Tc, La 6
2. Họ Cà phê Rubiaceae
4 Dành dành Gardenia jasminoides La, Ho, Qa, Re 7
5 Bí kỳ nam Hydnophytum formicarum Th 8
6 Lưỡi rắn trắng Hedyotis diffusa Tc 7, 9, 10, 11
7 Nhàu Morinda citrifolia La, Qa, Re 9, 10, 11
8 Gáo vàng Nauclea orientalis VoT, VoR 5
9 Lưỡi rắn Hedyotis corymbosa Tc 7
3. Họ Thầu dầu Euphorbiaceae
10 Diệp hạ châu Phyllanthus urinaria Tc 7, 10, 11
11 Chùm ruột Phyllanthus acidus La, Qa, VoT, Re 8, 9, 10, 11
12 Me rừng Phyllanthus emblica Qa, La, VoT, Re 5, 8
4. Họ Cà Solanaceae
13 Thù lù lơng Physalis angulata Tc, Qa 5
5. Họ Ráy Araceae
14 Mớp gai Lasia spinosa Th 7, 11
6. Họ Dứa dại Pandanaceae
15 Dứa gai Pandanus tonkinensis Re, Ho, Th 5
7. Họ Cỏ roi ngựa Rerbeaceae
16 Vọng cách Premma integrifolia La, Th, Re, VoT 7, 10
8. Họ Chùm ớt Bignoniaceae
17 Quao nước Dolichandrone spathacea Vo, La 5, 9
18 Núc nác Oroxylum indicum Vo, Ha, Th 5, 7
9. Họ Dâu tằm Moraceae
19 Dàn gừa Ficus microcarpa La, ReP 7
20 Đa búp đỏ Ficus elastica Re 7
21 Dâu tằm Morus alba La, Qa, VoT, Th,
Re
7
10. Họ Gừng Zingiberaceae
22 Thiền liền Kaempferia galanga Cu 5,7
TT Tên Việt Nam Tên khoa học Bộ phận dùng Mục đích sử dụng
11. Họ Hoa giấy Nyctaginaceae
24 Bơng phấn Mirabilis jalapa Tc, La, Re 7, 10
12. Họ Na Annonaceae
25 Cị sen Miliusa velutina VoT, Go 5, 7, 10
26 Bình bát nước Annona glabra Qa 9
13. Họ Trúc đào Apocynaceae
27 Dừa cạn Catharanthus roseus Tc, La, Re 5, 6, 7
28 Sứ cùi Plumeria rubra Ho 7
29 Mưc hoa trắng Holarrhena
antidysenterica
Th, Ha 7
14. Họ Sổ Dilleniaceae
30 Sổ trai Dillenia ovata Qa, VoT 7, 10
31 Chặc chiều Tetracera asiatica Tc, Re 8
15. Họ Hoa mõm sĩi
Scrophulariaceae
32 Nam nhân trần Adenosma caeruleum Tc, Th, La 1, 7, 8
33 Rau đắng biển Bacopa monnieri Tc 1
16. Họ Vang Caesalpiniaceae
34 Muồng trâu Senna alata Tc, La, Ha 8
35 Mĩng bị tai voi Bauhinia malabarica La, Re, Ha 8
36 Muồng lá khế Senna occidentalis La, Re, Ha 9, 10, 11
37 Vang Caesalpinia sappan Th 9, 10, 11
17. Họ Bạch hoa Capparaceae 38 Màn màn tím Cleome chelidonii Tc, Re 5, 7 39 Màn màn vàng Cleome viscosa Tc 9, 10, 11 18. Họ Bầu bí Cucurbitaceae 40 Gấc Momordica cochinchinessis Ha 5, 6, 7
41 Khổ qua Momordica charantia Qa, Ho, Re 1, 8
19. Họ Rau dền Amaranthaceae
42 Rau dệu Alternanthera sessilis Tc 8
43 Cỏ xước Achyranthes aspera Tc, Re 8
20. Họ Nhân sâm Araliaceae
44 Đinh lăng Polyscias fruticosa La, Re 9, 10, 11
45 Ngũ gia bì Schefflera heptaphylla VoT, VoR, La 5, 7, 9
21. Họ Khoai lang
Convolvulaceae
46 Bạc thau tím Argyreia acuta Th, La 9, 10, 11
47 Rau muống Ipomoea aquatic Tc 8
22. Họ Cúc Asteraceae
48 Cải trời Blumea lacera Tc 9, 10, 11
49 Cỏ mực Eclipta prostrate Tc, Th 7
50 Cúc chỉ thiên Elephantopus scaber Tc 5, 7
Ghi chú: Tc-Tồn cây; La-Lá; Ho-Hoa; Qa-Quả; Re-Rễ; Th-Thân; VoT-Vỏ thân; VoR-Vỏ rễ; Ha-Hạt; ReP-Rễ phụ. 1-Gan nhiễm mỡ; 2-Viêm gan do rượu; 3-Viêm gan do thuốc; 4-Viêm gan do virus; 5-Xơ gan; 6- Ung thư gan; 7-Viêm gan; 8-Đau gan; 9-Bổ gan; 10-Giải độc gan; 11-Mát gan.
Các loại cây dược liệu được sử dụng trong điều trị các bệnh về gan đa dạng về họ thực vật, đã được xác định tỷ lệ sử dụng trình bày trong Hình 4.1. Tỷ lệ các họ thực vật được sử dụng trong điều trị bệnh gan dao động từ 1,96% đến 11,76%, trong đĩ, họ thực vật được sử dụng trong điều trị bệnh gan nhiều nhất là họ Cà phê (Rubiaceae), chiếm tỷ lệ 11,76%. Các lồi cây thường được dùng trong điều trị các bệnh về gan thuộc họ Cà phê gồm Dành dành (Gardenia jasminoides), Bí kỳ nam (Hydnophytum formicarum), Lưỡi rắn trắng (Hedyotis diffusa), Nhàu (Morinda citrifolia), Gáo vàng
(Nauclea orientalis), Lưỡi rắn (Hedyotis corymbosa). Theo Martins và Nunez (2015), thực vật họ Cà phê (Rubiaceae) cĩ chứa một lượng lớn các hợp chất như iridoid, anthraquinone, triterpene, indole alkaloid và các alkaloid khác, đặc biệt là sự sản xuất các alkaloid cĩ hoạt tính sinh học. Ngồi ra, các nghiên cứu khác cho thấy thực vật họ Cà phê cịn chứa hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng cao và cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa như trái Dành dành (Gardenia jasmine Ellis) (Debnath et al., 2011); trái Nhàu (Morinda citrifolia) (Krishnaiah et al., 2013; Shami, 2015); hột Cà phê (Coffea arabica)(Affonso et al., 2016); lá Gáo vàng (Nauclea orientalis Linn.) (Raghavamma
et al., 2011) và nhiều lồi khác. Chứng tỏ họ Cà phê là nguồn chứa các hợp chất cĩ hoạt tính sinh học mới đầy hứa hẹn, cĩ thể tạo ra các sản phẩm mới dưới dạng các phân tử hoạt động hoặc thậm chí là nguyên mẫu thuốc. Nhiều cây thuộc họ này được sử dụng rộng rãi trong y học dân gian và một số cĩ tác dụng kháng viêm, giảm đau, kháng khuẩn, gây đột biến, kháng virus, kháng oxy hĩa, hiệu quả trên các bệnh mạch máu cũng như hoạt động trên hệ thần kinh trung ương (Heitzman et al., 2005). Ngồi ra, họ Cà phê là họ thực vật lớn, ở Việt nam, đặc biệt là vùng Đồng bằng sơng Cửu long, thực vật họ Cà phê phân bố rộng rãi nhiều nơi. Trong các lồi điều tra được thuộc họ Cà phê, Dành dành, Bí kỳ nam và Nhàu đã được quan tâm nghiên cứu nhiều ở trong nước và trên thế giới. Trong khi các lồi Gáo vàng, Lưỡi rắn và Lưỡi rắn trắng chưa được nghiên cứu nhiều. Bên cạnh đĩ, các lồi như Trang to, Gáo trắng, Mơ lơng, Mơ leo vẫn cịn mọc hoang và phổ biến, nhưng chưa được quan tâm nghiên cứu để khai thác theo hướng dược liệu. Vì vậy, các lồi Mơ lơng, Mơ leo, Trang to, Gáo vàng, Gáo trắng, Lưỡi rắn và Lưỡi rắn trắng được chọn thu mẫu để nghiên cứu sàng lọc khả năng kháng oxy hĩa và bảo vệ gan.
Hình 4.1: Tỷ lệ (%) các họ thực vật sử dụng trong điều trị bệnh gan
4.2 Hiệu suất ly trích cao một số cây thuộc họ Cà phê
Theo quy trình ly trích cao, các mẫu từ một số cây thuộc họ Cà phê bao gồm lá Trang to, hoa Trang to, ba bộ phận (lá, vỏ thân, rễ) cây Gáo vàng, ba bộ phận (lá, vỏ thân, rễ) cây Gáo trắng, lá Mơ lơng, lá Mơ leo, cây Lưỡi rắn, cây Lưỡi rắn trắng được ngâm chiết trong dung mơi methanol sau đĩ cơ đuổi dung mơi thu được các cao methanol. Các cao chiết sau khi cơ quay cĩ dạng đặc sệt, màu sắc khác nhau, hiệu suất ly trích cao được trình bày trong Bảng 4.2. Hiệu suất ly trích cao methanol tính theo khối lượng tươi tương đối đồng đều. Trong khi đĩ, hiệu suất ly trích cao methanol tính theo khối lượng khơ cĩ phần chênh lệch khá cao giữa các mẫu thực vật.
Bảng 4.2: Hiệu suất ly trích cao của một số cây thuộc họ Cà Phê
STT Tên cao Mẫu
tươi (g) Mẫu khơ (g) Độ ẩm mẫu (%) Cao (g) Độ ẩm cao (%) Hiệu suất (%) Tươi Khơ 1 Lá Mơ lơng 3500 460 8,33±0,58 91,95±0,62 5,72±0,03 2,63±0,02 19,99±0,14 2 Lá Mơ leo 2800 440 7,67±0,58 68,06±0,49 5,57±0,07 2,43±0,02 15,47±0,11 3 Lá Trang to 4100 2100 7,33±0,58 87,55±2,12 4,86±0,12 2,14±0,05 4,17±0,1 4 Hoa Trang to 2500 570 6,33±0,58 61,7±2,82 3,91±0,02 2,45±0,11 10,83±0,5 5 Lá Gáo vàng 4400 1300 6,33±0,58 98,41±0,81 4,92±0,13 2,24±0,02 7,57±0,06 6 Vỏ Gáo vàng 4000 1340 5,00±0,00 41,25±1,29 3,76±0,03 1,03±0,03 3,08±0,1 7 Rễ Gáo vàng 4000 1600 3,67±0,58 43,52±0,75 4,02±0,16 1,09±0,02 2,72±0,05 8 Lá Gáo trắng 3850 890 5,67ef±0,58 41,54±0,75 4,91±0,16 1,08±0,02 4,67±0,07 9 Vỏ Gáo trắng 3900 1280 5,00±0,00 37,52±0,68 3,63±0,04 0,96±0,02 2,93±0,05 10 Rễ Gáo trắng 2500 970 4,33±0,58 24,98±0,9 3,83±0,02 1±0,04 2,58±0,09 11 Lưỡi rắn 2500 550 6,33±0,58 49,5±0,64 5,77±0,12 1,98±0,03 9±0,12 12 Lưỡi rắn trắng 2000 420 6,67±0,58 31,5±0,78 5,92±0,08 1,58±0,04 7,5±0,19
Thành phần hĩa học và hoạt tính của các cao chiết thực vật được chi phối đáng kể bởi qui trình tách chiết cũng như các loại dung mơi được sử dụng tách chiết. Cao thơ hay cịn gọi là cao tổng được thu nhận trước khi tiến hành phân đoạn là cách tiếp cận của nhiều nghiên cứu khảo sát hoạt tính sinh học của thực vật (Koehn, 2008). Cao tổng thu được từ mẫu ngâm trong methanol được đánh giá chứa đa dạng các hợp chất của thực vật hơn một số dung mơi khác (Felhi et al., 2017). Hơn nữa, theo Truong et al. (2019), chiết cao trong methanol cĩ hiệu suất cao hơn các dung mơi khác, cũng như kết quả định lượng các thành phần phenolic, flavonoid, alkaloid và terpenoid cao hơn. Kết quả Bảng 4.2 cho thấy, các mẫu hoa hoặc lá cho hiệu suất ly trích cao hơn so với các mẫu vỏ thân hoặc rễ. Cĩ thể nhận thấy rằng các hợp chất ít phân cực chiếm tỉ lệ cao trong cao methanol, nhất là cao lá và cao hoa.
4.3 Hiệu quả kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
4.3.1 Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết
Định tính sơ bộ thành phần hĩa học cĩ trong các cao methanol được chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cho thấy sự cĩ mặt của các thành phần cĩ hoạt tính sinh học khác nhau như: flavonoid, phenol, alkaloid, tannin, terpenoid, glycoside (Phụ lục 1.2).
Hàm lượng polyphenol tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là acid gallic trong dãy nồng độ từ 2 đến 10 µg/mL (y=0,161x+0,0807; R²=0,998). Hàm lượng flavonoid tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là quercetin trong dãy nồng độ từ 20 đến 120 µg/mL (y=0,0087x–0,0069; R²=0,989). Hàm lượng alkaloid tổng được xác định dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính được xây dựng với chất chuẩn là atropine trong dãy nồng độ từ 10 đến 500 µg/mL (y=0,0006x+0,0386; R²=0,996). Trên cơ sở các phương trình đường chuẩn này, hàm lượng polyphenol tổng, flavonoid tổng và alkaloid tổng cĩ trong các cao chiết được xác định tương đương acid gallic, quercetin và atropine được trình bày ở Bảng 4.3.
Dựa vào kết quả nghiên cứu ở Bảng 4.3 cho thấy, các cao chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cĩ chứa hàm lượng polyphenol tổng dao động từ 16,5±0,52 mg GAE/g (cao chiết lá Mơ lơng) đến 762,3±62,5 mg GAE/g (cao chiết hoa Trang to). Hàm lượng flavonoid tồn phần dao động từ 10,6±0,22 mg QE/g (cao chiết Lưỡi rắn) đến 679,5±35,6 mg QE/g (cao chiết hoa Trang to) và hàm lượng alkaloid tổng dao động từ 58,6±2,4 mg AE/g (cao chiết lá Gáo trắng) đến 895,4±18,1mg AE/g (cao chiết rễ Gáo vàng).
Bảng 4.3: Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết từ một số thực vật họ Cà phê Cao chiết (n=3) Hàm lượng Polyphenol (mgGAE/g) Flavonoid (mg QE/g) Alkaloid (mg AE/g) Lá Mơ Lơng 16,5±0,52h 329,4±1,02d 100,2±6,36g Lá Mơ Leo 16,7±0,78h 294,7±1,54d 101,2±4,22g Lá Trang To 360,8±10,0b 676,3±14,5a 284,8±19e Hoa Trang to 762,3±62,5a 679,5±35,6a 82,2±10,4gh Lá Gáo Vàng 51,4±0,91fg 132,5±1,94ef 154,4±2,40f Vỏ thân Gáo vàng 155,5±0,15d 145,6±1,18e 773,6±12,7b Rễ Gáo vàng 38,2±0,2gh 104,1±1,6f 895,4±18,1a Lá Gáo trắng 376,4±2,22b 613,5±90,3a 61,3±2,40i Vỏ thân Gáo trắng 327,2±5,84c 392,3±16,8c 430,1±14,5d Rễ Gáo trắng 319,4±0,21c 554,5±44,5b 663,1±16,2c Lưỡi rắn 80,4±5,13ef 10,6±0,38g 58,6±8,67i Lưỡi rắn trắng 83,5±1,99e 398,5±11,0c 62,7±9,62hi
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau khác biệt khơng cĩ ý nghĩa ở mức 5%.
Nhìn chung các cao chiết nghiên cứu cĩ hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng khá cao. Cĩ 5 cao chiết gồm hoa Trang to, lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng và rễ Gáo trắng cĩ hàm lượng polyphenol và flavonoid cao vượt trội, trong khi cao chiết cĩ hàm lượng alkaloid tổng cao nhất là rễ Gáo vàng. Như vậy, kết quả nghiên cứu chứng minh rằng các cao methanol được chiết từ một số thực vật thuộc họ Cà phê cĩ chứa nhiều hợp chất sinh học đầy tiềm năng ứng dụng.
4.3.2 Hiệu quả kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
4.3.2.1 Hiệu quả trung hịa gốc tự do 2,2- diphenyl- 1 picrylhydrazyl (DPPH) của các cao chiết
Hoạt tính kháng oxy hĩa của các cao methanol được chiết từ một số cây thuộc họ Cà phê thể hiện qua hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH được trình bày trong Bảng 4.4. Kết quả cho thấy hiệu suất loại bỏ gốc tự do DPPH tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết, khi tăng nồng độ của cao chiết thì hiệu suất loại bỏ gốc tự do tăng. Kết quả trình bày ở Bảng 4.4 cho thấy, các cao methanol lá Trang to, hoa Trang to, lá Gáo trắng và vỏ thân Gáo trắng