4.4.1 Khả năng điều hịa enzyme AST và ALT của các cao chiết
Carbon tetrachloride đã được biết đến từ rất lâu với khả năng gây độc cho gan và thường được dùng phổ biến trong các nghiên cứu để gây tổn thương gan trên động vật thí nghiệm. Sau 4 tuần cho chuột uống CCl4, gan chuột thử nghiệm đã bị xơ hĩa và thay đổi các chỉ số sinh hĩa của gan. Khi tế bào gan bị tổn thương, các enzyme aspartate transaminase (AST) và alanine aminotransferase (ALT) được phĩng thích vào máu làm cho hàm lượng của các enzyme này đo được trong máu tăng cao. Thơng qua việc xác định hàm lượng AST, ALT trong huyết thanh của nhĩm chuột được gây độc bởi CCl4 khơng uống cao chiết (nhĩm đối chứng bệnh) và các nhĩm được gây độc bởi CCl4 được cho
uống cao chiết thực vật và nhĩm chuột bình thường uống nước cất (đối chứng bình thường) cĩ thể xác định được hiệu quả làm giảm enzyme gan của các cao chiết.
Bảng 4.12: Hàm lượng enzyme gan của các nhĩm chuột thí nghiệm
Nhĩm thí nghiệm Hàm lượng enzyme (U/L)
AST ALT Bình thường 169±12,4fg 34,4±8,9c Olive, DMSO 1% 178,2±43fg 69,8±21,3c CCl4 1386,4±354,5a 921,2±375a CCl4, silymarin 16 mg/kg 257,6±134,5ef 113,6±26,8c CCl4, lá Mơ lơng 100 mg/kg 423±149,1de 418,6±703,7b CCl4, lá Mơ lơng 200 mg/kg 178,6±157,3fg 119,2±156,5c CCl4, lá Mơ lơng 400 mg/kg 172,8±137,3fg 87±78,7c CCl4, lá Mơ leo 100 mg/kg 208,8±147,7fg 75,8± 54,8c CCl4, lá Mơ leo 200 mg/kg 187,2±91,4fg 94,8± 49,2c CCl4, lá Mơ leo 400 mg/kg 181,8±123,4fg 107,3±87,9c CCl4, lá Trang to 100 mg/kg 137,4±26,3fg 104,8±14,8c CCl4, lá Trang to 200 mg/kg 119,2±46,4fg 84,2±20c CCl4, lá Trang to 400 mg/kg 88,8±14,6fg 45± 21,1c CCl4, lá Gáo trắng 100 mg/kg 125±29,7fg 30±8,3c CCl4,lá Gáo trắng 200 mg/kg 81±12,5g 29,8±8,5c CCl4,lá Gáo trắng 400 mg/kg 57± 15,4g 21,4±3,8c CCl4, vỏ thân Gáo trắng 100 mg/kg 107,2±45,1fg 54,4±36,8c CCl4, vỏ thân Gáo trắng 200 mg/kg 54,8±21,9g 27,8±17,9c CCl4, vỏ thân Gáo trắng 400 mg/kg 37,4±10,7g 22±10,3c CCl4, rễ Gáo trắng 100 mg/kg 451±190,3d 88,8± 16c CCl4, rễ Gáo trắng 200 mg/kg 106,2±39,1fg 66,8± 40,9c CCl4, rễ Gáo trắng 400 mg/kg 60,8±10,5g 17,8±4,3c CCl4, lá Gáo vàng 100 mg/kg 1104,6± 411,8b 415,2±159,1b CCl4, lá Gáo vàng 200 mg/kg 676,2±362c 372,8± 201,9b CCl4, lá Gáo vàng 400 mg/kg 122,8±16,8fg 30,2±15,8c CCl4, vỏ thân Gáo vàng 100 mg/kg 116± 13,2fg 93,8± 27,9c CCl4, vỏ thân Gáo vàng 200 mg/kg 91,6±5,2fg 77,6±18,1c CCl4, vỏ thân Gáo vàng 400 mg/kg 37,8±12g 24,4±6,4c CCl4, rễ Gáo vàng 100 mg/kg 143,8±33,7fg 115,2± 13c CCl4, rễ Gáo vàng 200 mg/kg 108,4±12,1fg 90± 11,7c CCl4, rễ Gáo vàng 400 mg/kg 44,4±6,7g 28,8±11,4c
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=5; Các ký tự giống nhau theo sau trong cùng một cột khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%.
Số liệu được trình bày ở Bảng 4.12 cho thấy, nhĩm chuột đối chứng bệnh và nhĩm chuột đối chứng bình thường cĩ sự khác biệt đáng kể (p<0,05) trong các chỉ số enzyme gan AST và ALT. Hàm lượng AST của nhĩm chuột đối chứng bệnh và nhĩm chuột bình thường đo được lần lượt là 1386,4±354,5 U/L và 169±12,4 U/L; hàm lượng ALT đo được lần lượt là 921,2±375 U/L và 34,4±8,9 U/L. Từ đây cho thấy, khi chuột uống CCl4 kéo dài 4 tuần thì hàm lượng enzyme AST tăng cao gấp 8 lần và ALT tăng gấp 26 lần so với nhĩm chuột đối chứng bình thường, chứng tỏ chuột uống CCl4 đã bị nhiễm độc gan. Ở nhĩm chuột uống dầu olive và DMSO 1% đo được hàm lượng AST là 178,2±43 U/L và
ALT là 69,8±21,3 U/L, so với nhĩm chuột đối chứng bình thường thì hàm lượng AST và ALT ở hai nhĩm này khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (p>0,05), cho thấy việc sử dụng dầu olive và DMSO 1% làm dung mơi pha cao chiết và pha CCl4 trong thí nghiệm khơng ảnh hưởng đến hàm lượng enzyme AST và ALT trong huyết thanh chuột. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả của các nghiên cứu trước, DMSO 1% được sử dụng làm dung mơi hịa tan một số hĩa chất, thuốc thí nghiệm hoặc dùng trong đối chứng âm (khơng gây độc) trong các thí nghiệm kháng khuẩn (Wicaksono et al., 2009; Koarslan et al., 2016). Ở nhĩm chuột uống CCl4 được điều trị bằng silymarin hàm lượng AST đo được trong máu là 257,6±134 U/L và ALT là 113,6±26,8 U/L, khi so với hàm lượng AST và ALT của nhĩm chuột đối chứng bệnh thì silymarin 16 mg/kg đã làm giảm được 92,7±11,05% lượng AST và 91,0±3,02% ALT. Kết quả cho thấy silymarin đã ức chế được tác hại CCl4, bảo vệ được tế bào gan.
Chuột được gây nhiễm độc gan bằng CCl4 và điều trị bằng các cao chiết mức enzyme AST và ALT trong huyết thanh chuột thí nghiệm đã được cải thiện rõ rệt so với nhĩm đối chứng bệnh. Ở các nồng độ cao chiết 100, 200 và 400 mg/kg khối lượng chuột, các cao chiết được khảo sát đều cho kết quả làm giảm hàm lượng enzyme AST và ALT ở các nhĩm chuột thí nghiệm khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bệnh. Các cao chiết lá Mơ lơng, lá Mơ leo, lá Trang to và lá Gáo vàng cĩ hiệu quả hạ enzyme gan tương đương nhau. Ở các nhĩm chuột uống cao chiết liều 200 mg/kg và 400mg/kg cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm bình thường. Các cao chiết lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, vỏ thân Gáo vàng và rễ Gáo vàng cho hiệu quả hạ enzyme gan tương đương nhau. Ở liều 100 mg/kg đã cho kết quả cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nhĩm bình thường hoặc tương đương với silymarin. Ở các nhĩm chuột uống cao chiết 200 và 400 mg/kg đã cho kết quả cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm uống cao chiết liều 100 mg/kg.
Xét hiệu quả hạ enzyme gan ở nồng độ cao chiết 100 mg/kg khối lượng chuột, nhĩm chuột uống cao chiết lá Gáo vàng cĩ hàm lượng enzyme AST là 1104,6±411,8 U/L cao gấp 6 lần so với nhĩm bình thường và ALT là 415,2±159,1 U/L cao gấp 11 lần so với nhĩm bình thường, nhưng so với nhĩm đối chứng bệnh thì khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê. Nhĩm chuột uống cao chiết rễ Gáo trắng cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bệnh, hàm lượng AST là 451±190,3 U/L cao gần 3 lần so với bình thường và ALT là 88,8±16 U/L khác biệt khơng ý nghĩa thống kê so với bình thường. Nhĩm chuột uống cao chiết lá Mơ lơng cĩ hàm lượng AST 423±149,1 U/L gấp 2,5 lần và ALT 418,6±703,7 U/L gấp 12 lần so với bình thường. Nhĩm chuột uống cao lá Mơ leo cĩ hàm lượng AST 208,8±147,7 U/L và ALT 75,8±54,8 U/L tương đương
với nhĩm chuột uống silymarin 16 mg/kg khối lượng chuột cĩ giá trị AST 257,6±134,5 U/L và ALT 113,6±26,8 U/L. Các nhĩm chuột uống cao chiết lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, vỏ thân Gáo vàng và rễ Gáo vàng cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT tương đương nhau và khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với nhĩm bình thường. Ở nồng độ 100 mg/kg khối lượng chuột, cao chiết lá Gáo trắng cho kết quả hạ enzyme AST và ALT tốt nhất.
Ở liều 200 mg/kg khối lượng chuột, nhĩm chuột uống cao chiết lá Gáo vàng cĩ hàm lượng enzyme AST là 676,2±362 U/L gấp 4 lần và ALT là 372,8±201,9 U/L gấp 11 lần so với nhĩm đối chứng bình thường. Các nhĩm chuột uống cao chiết lá Mơ leo, lá Mơ lơng, lá Trang to, rễ Gáo vàng, rễ Gáo trắng cĩ hàm lượng enzyme AST giảm lần lượt trong khoảng từ 187,2±91,4 U/L đến 106,2±39,1 U/L và hàm lượng ALT giảm lần lượt trong khoảng từ 119,2±156,5 U/L đến 66,8±40,91 U/L. Các nhĩm chuột uống cao chiết vỏ thân Gáo vàng, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng cĩ hàm lượng enzyme AST trong khoảng từ 91,6±5,2 U/L đến 54,8±21,9 U/L và hàm lượng ALT trong khoảng từ 77,6±18,1 U/L đến 27,8±17,9 U/L, theo thứ tự hàm lượng các enzyme giảm dần từ vỏ thân Gáo vàng, lá Gáo trắng và vỏ thân Gáo trắng. Ở liều 200 mg/kg khối lượng chuột, cao chiết vỏ thân Gáo trắng cho kết quả hạ enzyme AST và ALT tốt nhất.
Ở liều cao chiết 400 mg/kg khối lượng chuột, nhĩm chuột uống cao chiết lá Mơ leo và nhĩm chuột uống cao chiết lá Mơ lơng cĩ hàm lượng AST lần lượt là 181,7±123,3 U/L và 122,8±16,7 U/L, ALT lần lượt là 107,2±87,9 U/L và 87±78,7 U/L. Các nhĩm chuột uống cao chiết lá Gáo vàng, lá Trang to, rễ Gáo trắng, lá Gáo trắng, rễ Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng và vỏ thân Gáo trắng cĩ hàm lượng AST giảm lần lượt từ 122,8±16,7 U/L đến 37,4±10,7 U/L; hàm lượng ALT cĩ giá trị từ 45±21,0 U/L (nhĩm uống cao chiết lá Trang to) đến 17,8±4,3 U/L (nhĩm uống cao chiết rễ Gáo trắng), các nhĩm uống cao chiết lá Gáo vàng, rễ Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng, vỏ thân Gáo trắng và lá Gáo trắng cĩ giá trị ALT gần như nhau, dao động trong khoảng 21,4±3,7 U/L đến 30,1±15,8 U/L. Nếu xét về mặt thống kê, ở liều 400 mg/kg các nhĩm chuột uống cao chiết cĩ hàm lượng AST và ALT hầu như khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bình thường, trong khi hàm lượng ALT của nhĩm uống cao chiết lá Mơ leo và nhĩm uống cao chiết lá Mơ lơng cao lần lượt gấp 3 và gấp 2 lần và khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bình thường (p<0,5). Từ kết quả trên cho thấy, ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng chuột cĩ 7 cao chiết thí nghiệm cho kết quả hạ enzyme AST và ALT về tương đương giá trị bình thường là cao chiết lá Gáo vàng, lá Trang to, rễ Gáo trắng, lá Gáo trắng, rễ Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng và vỏ thân Gáo trắng. Trong đĩ, cao chiết vỏ thân Gáo trắng và vỏ thân Gáo vàng cho kết quả hạ enzyme AST và ALT tốt nhất. Nếu xét ở cả 3 liều khảo
sát 100, 200, 400 mg/kg cĩ 5 cao chiết bao gồm lá Trang to, lá Gáo trắng, vỏ thân Gáo trắng, vỏ thân Gáo vàng và rễ Gáo vàng làm giảm AST và ALT hiệu quả.
4.4.2 Khả năng kháng oxy hĩa in vivo của các cao chiết trên chuột tổn thương
gan bằng CCl4
Hoạt tính kháng oxy hĩa bảo vệ gan của cao chiết từ các cây thuộc họ Cà phê cũng thể hiện thơng qua hoạt động điều hịa hàm lượng MDA và GSH trong mơ gan của các nhĩm chuột thí nghiệm. Hoạt tính kháng oxy hĩa in vivo của các cao chiết được đánh giá dựa trên khả năng kháng peroxide hĩa lipid màng tế bào và sản sinh chất kháng oxy hĩa nội sinh. Nghiên cứu dựa vào hàm lượng MDA để xác định sự kháng peroxide hĩa lipid màng tế bào và hàm lượng GSH để xác định khả năng sản sinh chất kháng oxy hĩa nội sinh ở mơ gan chuột.
Quá trình peroxide hĩa lipid màng tế bào ở chuột uống CCl4 xảy ra dưới sự chuyển hĩa bởi các enzyme cytochrome P-450 của gan để chuyển hĩa CCl4 tạo thành các chất chuyển hĩa cĩ độc cao như gốc trichloromethyl (CCl3•) và peroxy trichloromethyl (CCl3OO•). Các gốc CCl3• và CCl3OO• cĩ khả năng liên kết cộng hĩa trị với protein hoặc lipid của màng tế bào và các bào quan, tách các nguyên tử hydro khỏi acid béo khơng bão hịa để bắt đầu quá trình peroxide hĩa lipid do đĩ gây tổn thương màng tế bào, rối loạn cân bằng nội mơi, rối loạn hoạt động của một số enzyme và cuối cùng gây ra tổn thương hoặc hoại tử tế bào gan (Mahmud et al., 2012). Quá trình peroxide hĩa lipid màng tế bào gan tạo ra nhiều MDA. Do đĩ, xác định hàm lượng MDA sẽ đánh giá được khả năng kháng peroxide hĩa lipid ở mơ gan của các cao chiết.
Kết quả thực nghiệm được trình bày ở Bảng 4.13 cho thấy, hàm lượng MDA ở mơ gan của nhĩm chuột đối chứng bệnh (uống CCl4) (18,6±0,44 nM MDA/g mơ) tăng cao gấp 11,64 lần so với nhĩm chuột bình thường (1,6±0,07 nM MDA/g mơ). Kết quả này cho thấy việc sử dụng CCl4 đã thúc đẩy quá trình peroxide hĩa lipid ở gan chuột. Chính quá trình peroxide hĩa lipid của màng tế bào gan dẫn đến việc giải phĩng các enzyme ALT và AST vào máu gây tăng hàm lượng ALT và AST trong máu đã được trình bày trong Bảng 4.12. Bên cạnh đĩ, ảnh hưởng của dầu olive và DMSO 1% đến hàm lượng MDA ở mơ gan chuột cũng được đánh giá. Kết quả cho thấy, hàm lượng MDA ở nhĩm chuột uống dầu olive và DMSO 1% là 1,45±0,07 nM MDA/g mơ, khác biệt khơng cĩ ý nghĩa (p>0,05) so với nhĩm chuột bình thường. Như vậy, dầu olive và DMSO 1% khơng ảnh hưởng đến hàm lượng MDA ở mơ gan chuột.
Glutathione (GSH) là một thiol nội bào trong các sinh vật sống, đĩng vai trị trung tâm trong việc điều phối quá trình bảo vệ kháng oxy hĩa trong cơ thể. Ở trạng thái stress oxy hĩa, GSH được chuyển đổi thành glutathione disulfide (GSSG) dẫn đến quá trình
peroxide hĩa lipid (Ghassam et al., 2014). Hàm lượng GSH giảm cĩ liên quan mật thiết đến việc tăng cường quá trình peroxide hĩa lipid ở nhĩm đối chứng bệnh. Kết quả thí nghiệm cho thấy nhĩm đối chứng bệnh cĩ hàm lượng GSH (126,3±10,7 nM GSH/g mơ) thấp hơn nhĩm chuột bình thường (524,1±77,3 nM GSH/g mơ) 4,15 lần. Kết quả này cĩ sự tương đồng với nghiên cứu của Ghassam et al. (2014), hàm lượng GSH giảm ở chuột bị tổn thương gan bởi CCl4. Ở nhĩm chuột uống dầu olive và DMSO 1%, hàm lượng GSH được xác định là khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê so với nhĩm chuột bình thường (p>0,05). Từ đĩ cho thấy dầu olive và DMSO 1% khơng ảnh hưởng đến hàm lượng GSH trong mơ gan chuột.
Các cao chiết được xem là cĩ khả năng chống lại tổn thương gan do CCl4 khi làm giảm được hàm lượng MDA trong gan. Các cao chiết nghiên cứu đều cĩ khả năng làm giảm hàm lượng MDA ở mơ gan chuột uống CCl4 theo liều sử dụng. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ lơng ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg cho thấy hiệu quả làm giảm hàm lượng MDA lần lượt xuống cịn 10,0±0,36 nM MDA/g mơ; 6,37±1,68 nM MDA/g mơ và 2,32±0,04 nM MDA/g mơ. Cao chiết lá Mơ lơng làm cho hàm lượng GSH từ 213,3±10,2 nM GSH/g mơ ở liều 100 mg/kg tăng lên 1030,1±19,1 nM GSH/g mơ ở liều 400 mg/kg. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ leo ở các liều 100, 200 và 400 mg/kg cho thấy cao chiết làm giảm hàm lượng MDA lần lượt xuống cịn 8,87±0,08 nM MDA/g mơ; 4,17±0,09 nM MDA/g mơ và 2,02±0,05 nM MDA/g mơ. Cao chiết lá Mơ leo làm cho hàm lượng GSH từ 237,9±10.1 nM GSH/g mơ ở liều 100 mg/kg tăng lên 1055,5±207,8 nM GSH/g mơ ở liều 400 mg/kg. Cả hai cao chiết khi so với nhĩm đối chứng bệnh cĩ thể thấy rằng hàm lượng MDA đã giảm và GSH đã tăng cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Bảng 4.13: Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột thí nghiệm
Nhĩm thí nghiệm Hàm lượng (nM/g mơ)
MDA GSH Bình thường 1,6±0,07op 524,1±77,3op Olive, DMSO 1% 1,45±0,07p 487,2±46p CCl4 18,6±0,44a 126,3±10,7q CCl4, silymarin 16 mg/kg 1,86±0,16m-p 949,3±10,4h-j CCl4, lá Mơ lơng 100 mg/kg 10,0±0,36b 213,3±10,2q CCl4, lá Mơ lơng 200 mg/kg 6,37±1,68f 750,8±36,8k-m CCl4, lá Mơ lơng 400 mg/kg 2,32±0,04mn 1030,1±19,1hi CCl4, lá Mơ leo 100 mg/kg 8,87±0,08c 237,9±10,1q CCl4, lá Mơ leo 200 mg/kg 4,17±0,09h 848,7±11,2j-l
CCl4, lá Mơ leo 400 mg/kg 2,02±0,05m-o 1055,5±11,5h
CCl4, lá Trang to 100 mg/kg 8,23±0,23d 493,3±28,1p CCl4, lá Trang to 200 mg/kg 4,47±0,36op 888,4±17,5i-k CCl4, lá Trang to 400 mg/kg 1,79±0,1gh 1226±52,5g CCl4, lá Gáo trắng 100 mg/kg 7,57±0,32e 590,6±96,7n-p CCl4, lá Gáo trắng 200 mg/kg 2,86±0,14kl 1499,8±99,7f CCl4,lá Gáo trắng 400 mg/kg 1,85±0,07n-p 2358,4±207,8c CCl4, rễ Gáo trắng 100 mg/kg 3,47±0,12ij 842,5±137j-l CCl4, rễ Gáo trắng 200 mg/kg 2,38±0,16lm 2114,7±87,6d CCl4, rễ Gáo trắng 400 mg/kg 1,7±0,05op 2652,2±180,6b CCl4, vỏ thân Gáo trắng 100 mg/kg 3,55±0,11i 758,3±83,1k-m
CCl4, vỏ thân Gáo trắng 200 mg/kg 2,08±0,07m-o 1913,4±254,6e
CCl4, vỏ thân Gáo trắng 400 mg/kg 1,75±0,05op 3078,1±264,5a