4.4.3.1 Cấu trúc đại thể gan chuột thí nghiệm
Bên cạnh việc kiểm tra hàm lượng enzyme gan trong huyết thanh thì nghiên cứu cũng ghi nhận kết quả quan sát đại thể và vi thể gan để làm rõ hơn khả năng bảo vệ gan của các cao chiết từ một số loại cây thuộc họ Cà phê. Hình thái gan giữa các nhĩm chuột đối chứng cĩ sự khác biệt rất rõ (Hình 4.2).
Hình 4.2: Hình gan của một số nhĩm chuột thí nghiệm A: bình thường; B: CCl4; C: CCl4+silymarin
D: CCl4+lá Trang 100; E: CCl4+lá Trang 200; F: CCl4+lá Trang 400; G: CCl4+lá Gáo trắng 100; H: CCl4+lá Gáo trắng 200; I: CCl4+lá Gáo trắng 400; K: CCl4+vỏ thân Gáo vàng 100; L: CCl4+ vỏ thân Gáo vàng 200; M: CCl4+ vỏ
thân Gáo vàng 400; N: CCl4+rễ Gáo vàng 100; O: CCl4+ rễ Gáo vàng 200; P: CCl4+ rễ Gáo vàng 400. Gan chuột nhĩm bình thường (đối chứng sinh lý) cĩ bề mặt trơn láng, mềm, mịn và cĩ màu đỏ sậm. Trong khi đĩ, nhĩm chuột đối chứng bệnh (uống CCl4) cĩ gan bị tổn thương, kích thước lớn do tế bào gan phình to, bề mặt gan gồ ghề, xơ dai. Các vùng trên gan cĩ màu sắc khơng đồng nhất, phần lớn bị tái nhạt do các mạch máu nằm lẫn trong tế
bào gan bị ảnh hưởng và đơi khi trên bề mặt xuất hiện các đốm màu bất thường. Riêng nhĩm chuột uống CCl4 sau đĩ được điều trị bằng silymarin, gan chuột cĩ nhiều cải thiện về mặt hình thái. Bề mặt gan chuột điều trị bằng silymarin chưa được láng mịn như nhĩm chuột bình thường nhưng so với nhĩm đối chứng bệnh (CCl4) thì mức độ tổn thương đã giảm rõ. Vì vậy, kết quả hình thái bên ngồi gan ở nhĩm chuột điều trị bằng silymarin cho thấy được khả năng bảo vệ gan của silymarin.
Các nhĩm chuột được gây bệnh bằng CCl4 và uống các cao chiết thực vật thì độ gồ ghề, xơ dai và màu sắc gan đã cải thiện đáng kể so với nhĩm gây bệnh bởi CCl4 khơng được điều trị. Ở nồng độ 100 mg/kg, hầu hết các nhĩm uống cao chiết đều cho kết quả gan cĩ bề mặt giảm gồ ghề rõ rệt so với đối chứng bệnh, tuy nhiên màu sắc gan vẫn cịn tái nhạt ở nhiều nhĩm. Trong đĩ, cĩ 4 cao chiết bao gồm lá Trang to, vỏ thân Gáo vàng, rễ Gáo vàng và lá Gáo trắng cho kết quả gan cĩ độ gồ ghề ít hơn và màu gan đỏ hơn các cao chiết cịn lại. Các nhĩm uống cao chiết ở liều 200 mg/kg bao gồm lá Trang to, vỏ thân Gáo vàng, rễ Gáo vàng và lá Gáo trắng cho kết quả tốt hơn các cao cịn lại. Ở liều 400 mg/kg, Các nhĩm uống cao chiết lá Trang to, rễ Gáo vàng, vỏ thân Gáo vàng, lá Gáo vàng và lá Gáo trắng ở liều 400 mg/kg cho thấy gan được cải thiện rất tốt, cĩ độ láng mịn và màu sắc đỏ thẩm cũng như thấy rõ túi mật cĩ nhiều dịch mật gần giống như nhĩm đối chứng bình thường. Riêng nhĩm uống cao chiết lá Mơ lơng, lá Mơ leo, vỏ thân Gáo trắng và rễ Gáo trắng cho kết quả gan vẫn cịn gồ ghề, màu gan cịn tái hơn nhĩm đối chứng bình thường.
4.4.3.2 Cấu trúc vi phẫu gan chuột thí nghiệm
Kết quả quan sát mơ học cung cấp bằng chứng hỗ trợ cho kết quả phân tích sinh hĩa. Phân tích mơ học gan của nhĩm chuột đối chứng bình thường cho thấy, cấu trúc gan bình thường với các tế bào gan trịn đều xếp khít nhau tạo thành các dãy hướng tĩnh mạch, nhìn rõ được xoang gan (Hình 4.3). Trong khi gan nhĩm chuột đối chứng bệnh (uống CCl4) cĩ cấu trúc bất thường, cĩ nhiều tế bào mất nhân. Bên cạnh, trong mơ gan cĩ các tế bào gan tích trữ nhiều giọt lipid trở nên trương phồng, nhiễm mỡ hoặc màng của hai tế bào liên kề bị dính lại với nhau dẫn đến khơng xác định được xoang gan. Ngồi ra, cĩ nhiều tế bào viêm quanh tiểu thùy, quanh mạch và len lõi giữa các tế bào. Silymarin là thuốc bảo vệ gan tiêu chuẩn được biết về khả năng bảo vệ màng tế bào và làm phục hồi sự tổn thương tế bào gan nhờ vào hiệu quả chống oxy hĩa và chống viêm (Federico et al., 2017). Kết quả nghiên cứu ở Hình 4.4 cũng cho thấy, cấu trúc mơ gan của các nhĩm chuột được gây bệnh điều trị bằng silymarin được cải thiện rõ rệt so với nhĩm chuột đối chứng bệnh. Mơ gan của nhĩm chuột bệnh điều trị bằng silymarin cĩ các tế bào gan với nhân trịn đều xếp thành dãy, nhìn rõ xoang gan và tế bào viêm đã giảm nhiều. Kết quả này tương tự với báo
cáo của Duong Thi Phuong Lien et al. (2016). Đồng thời, hoạt động bảo vệ gan của các cao chiết thực vật được biết cĩ liên quan đến việc duy trì hệ thống bảo vệ kháng oxy hĩa trong gan cùng với hoạt động làm sạch các gốc tự do (Subba et al., 2017). Các cơ chế bảo vệ bao gồm kích thích sự cảm ứng quá trình apoptosis trong các tế bào gan biến đổi, ức chế sự phát sinh hoặc loại bỏ gốc tự do, làm giảm sự peroxide hĩa lipid hoặc viêm trong gan và ngăn ngừa xảy ra hoại tử tế bào gan (Sanmugapriya and Venkataraman, 2006).
Hình 4.3: Mơ gan các nhĩm đối chứng
A: mơ gan chuột bình thường; B: mơ gan chuột uống CCl4; C: mơ gan chuột uống CCl4 và silymarin. 1- Tĩnh mạch; 2- Tế bào gan bình thường; 3- Xoang gan; 4- Tế bào gan phồng to; 5- Tế bào viêm (nhuộm hematoxylin và
eosin, độ phĩng đại ×400)
Các cao chiết thực vật được sử dụng nghiên cứu cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa do cĩ chứa thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng từ khá đến cao. Cĩ thể nhờ vào hoạt tính kháng oxy hĩa mà các cao chiết được nghiên cứu cĩ khả năng bảo vệ chống lại tổn thương gan do CCl4 gây ra.
Kết quả quan sát mơ gan chuột được gây bệnh và điều trị bằng các cao chiết lá Mơ lơng, lá Mơ leo và lá Trang to được trình bày ở Hình 4.4. Các nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ lơng (Hình 4.4D-F), ở liều 100 mg/kg vẫn cịn nhiều tế bào viêm. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ lơng liều 200 cĩ mơ gan mơ gan khác biệt khơng nhiều so với nhĩm điều trị liều 400 mg/kg, nhân tế bào gan trịn đều, tế bào mất nhân cũng giảm và các tế bào viêm đã giảm xuống đáng kể.
Nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ leo liều 100, 200 và 400 mg/kg khối lượng chuột đều cĩ dấu hiệu phục hồi của tế bào gan (Hình 4.4G-I). Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ leo liều 100 mg/kg, trong mơ gan các tế bào mất nhân đã giảm cũng như các tế bào tích mỡ đã giảm nhiều nhưng vẫn cịn nhiều tế bào viêm. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ leo liều 200 mg/kg, nhân tế bào gan trịn đều, giảm tế bào tích mỡ, tế bào viêm đã giảm nhưng tế bào mất nhân vẫn chưa giảm so với liều 100 mg/kg. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Mơ leo liều 400 mg/kg, mơ gan khơng khác biệt so với liều 200 mg/kg.
Hình 4.4: Mơ gan các nhĩm chuột thí nghiệm với các cao chiết lá Mơ lơng, lá Mơ leo và lá Trang to
D: CCl4+lá Mơ lơng 100; E: CCl4+ lá Mơ lơng 200; F: CCl4+ lá Mơ lơng 400; G: CCl4+lá Mơ leo 100; H: CCl4+ lá Mơ leo 200; I: CCl4+ lá Mơ leo 400; K: CCl4+lá Trang to 100; L: CCl4+ lá Trang to 200; M: CCl4+ lá Trang to 400
(nhuộm hematoxylin và eosin, độ phĩng đại ×400).
Cao chiết lá Trang to cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa và kháng viêm mạnh và cĩ chứa thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng khá cao. Nhờ vào hoạt tính kháng oxy hĩa và kháng viêm, lá Trang to cĩ khả năng bảo vệ chống lại tổn thương gan do CCl4 gây ra. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết lá Trang to ở liều 100 mg/kg, trong mơ gan các tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ đã giảm, tế bào viêm trong mơ và trong xoang tĩnh mạch giảm nhưng vẫn cịn nhiều tế bào viêm quanh các tiểu thùy, chưa khác biệt nhiều so với nhĩm đối chứng bệnh. Ở liều 200 mg/kg, tế bào gan cĩ nhân trịn đều, tế bào tích mỡ và tế bào viêm giảm, quan sát được dãy tế bào gan. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết lá Trang to liều 400 mg/kg, mơ gan được cải thiện nhiều so với nhĩm đối chứng bệnh (Hình 4.4K-M).
Hình 4.5: Mơ gan các nhĩm chuột thí nghiệm với các cao chiết cây Gáo trắng N: CCl4+lá Gáo trắng 100; O: CCl4+ lá Gáo trắng 200; P: CCl4+ lá Gáo trắng 400; Q: CCl4+vỏ thân Gáo trắng 100; R: CCl4+ vỏ thân Gáo trắng 200; S: CCl4+ vỏ thân Gáo trắng 400; T: CCl4+rễ Gáo trắng 100; U: CCl4+ rễ Gáo trắng
200; V: CCl4+ rễ Gáo trắng 400 (nhuộm hematoxylin và eosin, độ phĩng đại ×400)
Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Gáo trắng liều 100 mg/kg, các tĩnh mạch bị biến dạng, các tế bào mất nhân đã giảm, nhưng tế bào tích trữ mỡ vẫn cịn nhiều. Cịn nhiều tế bào viêm quanh các tĩnh mạch và quanh các tiểu thùy. Ở liều 200 mg/kg, các tĩnh mạch vẫn chưa trịn, trong mơ gan các tế bào viêm giảm rõ. Các tế bào gan nhân trịn, tuy nhiên tế bào mất nhân và tế bào tích trữ mỡ vẫn chưa giảm so với liều 100 mg/kg. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết lá Gáo trắng liều 400 mg/kg, tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ đã giảm nhiều, các tĩnh mạch trịn, bờ tĩnh mạch cĩ các tế bào gan nhân trịn xếp thành dãy tỏa ra ngoại vi, chỉ cịn rãi rác ít tế bào viêm ở bộ ba khoảng cửa và trong nhu mơ gan (Hình 4.5N-P).
Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết vỏ thân Gáo trắng liều 100 mg/kg, mơ gan cĩ tĩnh mạch giãn, biến dạng, khĩ nhận ra bộ ba khoảng cửa, cĩ rãi rác tế bào viêm trong nhu mơ gan. Cĩ nhiều tế bào tế bào mất nhân và tế bào tích trữ mỡ. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết vỏ thân Gáo trắng liều 200 mg/kg, các tĩnh mạch vẫn chưa trịn, tế bào mất nhân đã
giảm, tuy nhiên cĩ nhiều tế bào viêm trong xoang tĩnh mạch và trong nhu mơ gan. Ở nồng độ 400 mg/kg, các tĩnh mạch giãn rộng và cĩ nhiều tế bào viêm quanh các tĩnh mạch và trong nhu mơ gan. Tuy nhiên, quanh tĩnh mạch cĩ các tế bào gan nhân trịn (Hình 4.5Q- S).
Mơ gan ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết rễ Gáo trắng liều 100 mg/kg khơng nhìn rõ tiểu thùy gan, tĩnh mạch cửa giãn. Mơ gan cĩ rãi rác tế bào viêm quanh khoảng cửa và trong nhu mơ, tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ nhiều. Ở liều 200 mg/kg, cịn nhiều tế bào viêm quanh khoảng cửa, các tế bào tích mỡ và tế bào mất nhân vẫn nhiều. Ở liều 400 mg/kg, rãi rác ít tế bào viêm quanh khoảng cửa và trong nhu mơ gan, tế bào mất nhân vẫn cịn nhiều (Hình 4.5T-V).
Đối với các nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Gáo vàng (Hình 4.6D’-F’), nhĩm uống CCl4 và cao chiết lá Gáo vàng liều 100 mg/kg cĩ nhiều tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ, nhiều tế bào viêm tập trung xung quanh các tiểu thùy, khĩ nhận ra khoảng cửa. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết lá Gáo vàng liều 200 mg/kg, khác biệt khơng nhiều so với liều 100 mg/kg. Ở liều 400 mg/kg, tế bào gan cĩ nhân trịn, tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ giảm rõ, tuy nhiên cĩ nhiều tế bào viêm trong nhu mơ.
Quan sát mơ gan của nhĩm uống CCl4 và cao chiết vỏ thân Gáo vàng (Hình 4.6G’- I’) cho thấy, ở liều 100 mg/kg mơ gan cĩ nhiều tế bào mất nhân và tế bào tích mỡ, tế bào viêm giảm nhiều so với nhĩm đối chứng bệnh. Ở liều 200 mg/kg, trong nhu mơ và quanh tĩnh mạch cĩ ít tế bào viêm. Tế bào mất nhân đã giảm hơn so với nồng độ 100 mg/kg, nhưng cịn nhiều tế bào tích mỡ. Nhĩm uống liều 400 mg/kg, trong mơ vẫn cịn tế bào mất nhân và rãi rác tế bào viêm. Tĩnh mạch bị biến dạng, khĩ phân biệt được tiểu thùy.
Đối với các nhĩm chuột uống CCl4 và cao chiết lá Gáo vàng (Hình 4.6K’-M’), ở liều 100 mg/kg trong mơ cũng cĩ nhiều tế bào mất nhân và nhiều tế bào viêm quanh tiểu thùy, tế bào gan nhân trịn xếp thành dãy tỏa ra ngoại vi. Ở liều 200 mg/kg, tế bào mất nhân đã giảm so với nồng độ 100 mg/kg nhưng cịn nhiều tế bào viêm quanh mạch và quanh tiểu thùy. Ở nhĩm uống CCl4 và cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg, quan sát được các tế bào gan cĩ nhân trịn đều xếp thành dãy tỏa ra từ tĩnh mạch, tế bào mất nhân giảm rõ rệt, tuy nhiên cĩ rãi rác tế bào viêm. Cấu trúc mơ gan gần giống mơ gan nhĩm chuột đối chứng sinh lý.
Hình 4.6: Mơ gan các nhĩm chuột thí nghiệm với các cao chiết cây Gáo vàng D’: CCl4+lá Gáo vàng 100; E’: CCl4+ lá Gáo vàng 200; F’: CCl4+ lá Gáo vàng 400; G’: CCl4+vỏ thân Gáo vàng 100;
H’: CCl4+ vỏ thân Gáo vàng 200; I’: CCl4+ vỏ thân Gáo vàng 400; K’: CCl4+rễ Gáo vàng 100; L’: CCl4+ rễ Gáo vàng 200; M’: CCl4+ rễ Gáo vàng 400; 1: tĩnh mạch; 2: tế bào gan bình thường; 3: xoang gan; 5: tế bào viêm (nhuộm
hematoxylin và eosin, độ phĩng đại ×400)
Qua kết quả phân tích mơ bệnh học gan của các nhĩm chuột thử nghiệm cho thấy cao chiết lá Trang to cải thiện mơ bệnh học tốt hơn cao chiết lá Mơ lơng và cao chiết lá Mơ leo. Cao chiết lá Gáo trắng cĩ khả năng cải thiện mơ bệnh học gan tốt hơn hai loại cao chiết từ vỏ thân và rễ Gáo trắng. Cao chiết rễ Gáo vàng cĩ khả năng cải thiện mơ bệnh học gan tốt hơn hai loại cao chiết từ lá và vỏ thân Gáo vàng. Khi so sánh mơ gan của 3 cao chiết lá Trang to, lá Gáo trắng và rễ Gáo vàng, kết quả cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng cĩ khả năng bảo vệ mơ gan tốt nhất.
Nhiễm độc gan do CCl4 gây ra là một mơ hình động vật phổ biến để khảo sát khả năng hoạt động bảo vệ gan (Delire et al., 2015). Kết quả nghiên cứu cho thấy, các cao chiết thực vật họ Cà phê cĩ tác dụng làm giảm tổn thương gan ở chuột gây ra bởi CCl4. Trong nghiên cứu này, gây độc trên chuột bằng CCl4 dẫn đến sự gia tăng đáng kể các enzyme ALT, AST trong huyết thanh cho thấy gan đã bị tổn thương. Bên cạnh đĩ, tổn
thương mơ gan nghiêm trọng cũng quan sát được ở nhĩm gây độc bởi CCl4. Tất cả những thay đổi bệnh lý nêu trên được làm giảm đáng kể khi điều trị với các cao chiết, cho thấy rằng cao chiết thực vật họ Cà phê trong nghiên cứu cĩ thể làm giảm tổn thương gan ở chuột gây ra bởi CCl4.
Trong số nhiều sản phẩm thứ cấp trong quá trình peroxide hĩa lipid, MDA là một chỉ dấu sinh học thường được sử dụng để đánh giá quá trình peroxide hĩa lipid (Ayala et al., 2014) và mức MDA tăng cĩ thể phản ánh mức độ tổn thương do peroxide hĩa lipid trong tế bào gan (Djeffal et al., 2015). Nghiên cứu nhận thấy rằng hàm lượng MDA trong gan của chuột được gây độc bằng CCl4 tăng cao so với chuột bình thường. Chuột tổn thương gan bởi CCl4 được điều trị bằng các cao chiết nghiên cứu đã làm giảm đáng kể hàm lượng MDA. Do đĩ, cơ chế bảo vệ gan của các cao chiết cĩ thể là do tác dụng kháng oxy hĩa và kháng viêm.
Về chất kháng oxy hĩa nội sinh, GSH là một chất khử nội bào và bảo vệ tế bào chống lại các gốc tự do, các peroxide và các hợp chất độc hại khác. Ngồi ra, GSH là trung tâm bảo vệ kháng oxy hĩa của tế bào và hoạt động như một cofactor cần thiết cho các enzyme kháng oxy hĩa bao gồm GPx và GST (Attia et al., 2012; Klibet et al., 2016). Sự thiếu hụt GSH ở gan đã được chứng minh là cĩ liên quan đến sự nhiễm độc đối với hĩa chất, kể cả CCl4 (Sanmugapriya and Venkataraman, 2006). Trong nghiên cứu này, hàm lượng GSH trong mơ gan ở nhĩm gây độc bằng CCl4 thấp hơn 4 lần so với nhĩm