Cao ethyl acetate được hịa tan vào một lượng tối thiểu dung mơi Ea:MeOH (80:20), tiếp theo cho hấp phụ với 120 g silica gel, làm khơ dung mơi và nghiền mịn thành bột, sau đĩ tiến hành sắc ký nhanh-cột khơ với các thơng số sau:
Đường kính cột: d=20 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 450 g. Chiều cao lớp silica gel: l=5 cm. Khối lượng cao ethyl acetate: 101,6 g. Dung mơi ổn định: Hex:Ea (5:5).
Dung mơi giải ly cột được tăng dần độ phân cực bằng Ea và MeOH. Dung dịch sau khi ra khỏi cột được chứa trong các lọ cĩ dung tích 150 mL và được theo dõi quá trình chạy cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV, hiện hình bằng thuốc thử vaniline/H2SO4
(5%) trong methanol và gia nhiệt trên bếp điện. Các mẫu cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn, thu được 12 phân đoạn tương ứng lần lượt E1-E12.
Kết quả sắc ký cột trên cao phân đoạn ethyl acetate thu được 12 phân đoạn chính (ký hiệu E1-E12). Trong đĩ, phân đoạn E1, E2 được chọn để khảo sát tiếp. Kết quả sắc ký cột được trình bày chi tiết ở Bảng 4.24.
Bảng 4.24: Tĩm tắt kết quả sắc ký nhanh-cột khơ của cao ethyl acetate Hệ dung mơi giải ly Số lọ Phân đoạn Khối lượng (gam) Kết quả sắc ký lớp mỏng
Hex:Ea (5:5) 1-12 E1 6,4646 Vết kéo vệt màu cam
13-22 E2 4,4806 Vết kéo vệt màu cam, màu vàng
Ea (100%) 23-34 E3 10,0000 Vết chính màu cam, vết phụ kéo vệt mờ 35-52 E4 5,3485 Vết chính màu cam, nhiều vết phụ mờ Ea:Me (9:1)
53-55 E5 12,9261 Vết chính màu cam, vết phụ rất mờ 56-60 E6 15,6917 Vết chính màu cam, nhiều vết kéo vệt 61-67 E7 2,9549 Vết màu cam, vết phụ kéo vệt mờ Ea:Me (7:3)
68-71 E8 9,0833 Vết kéo vệt
72-90 E9 5,7925 Vết màu vàng, nhiều vết phụ kéo vệt 91-96 E10 0,9857 Vết chính màu vàng, nhiều vết phụ mờ Ea:Me (5:5) 97-100 E11 3,4070 Vết màu vàng, vết kéo vệt
Me (100%) 101-140 E12 1,1675 Vết kéo vệt cả bảng
Tổng khối lượng 78,3024
Hiệu suất 71,07%
Quan sát sắc ký lớp mỏng phân đoạn E1 cĩ vệt màu cam và phân đoạn E2 cĩ vệt màu cam, vàng với vết màu rõ rệt dễ quan sát nên được chọn để tiếp tục phân đoạn.
Phân đoạn E1:
Phân đoạn E1 đã được tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với các thơng số sau: Đường kính cột: d=3,0 cm.
Chiều dài cột: l=19 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 60 g. Khối lượng đoạn E1: 6,4646 g. Dung mơi ổn định cột Hex:DC (5:5).
Hệ dung mơi giải ly ban đầu là Hex:DC (5:5), tăng dần độ phân cực bằng dichloromethane và methanol. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV và thuốc thử vanilline trong H2SO4, gia nhiệt trên bếp điện. Các lọ cho vết giống nhau sẽ được gom chung, cơ đuổi dung mơi thu được 9 phân đoạn ký hiệu là E1.1-E1.9. Quá trình thực hiện được tĩm tắt ở Bảng 4.25.
Bảng 4.25: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E1 Hệ dung mơi giải ly Số lọ Phân đoạn Khối lượng (mg) Kết quả sắc ký lớp mỏng Hex:DC (5:5) 1-2 E1.1 13,9 Vết màu vàng nhạt, nhiều vết phụ mờ
Hex:DC (2:8) 3-20 E1.2 45,8 Vết chính màu vàng, vết phụ mờ
DC (100%) 21-41 E1.3 186,6 Vết màu cam, nhiều vết phụ kéo vệt DC:Me (98:2) 42-45 E1.4 983,9 Nhiều vết màu cam, vết phụ kéo vệt
DC:Me (97:3)
46-48 E1.5 1877,2 Vết màu vàng, nhiều vết phụ kéo vệt 49-56 E1.6 673,2 Vết màu vàng mờ, vết phụ kéo vệt dài 57-68 E1.7 Vết màu vàng rất mờ, vết phụ kéo vệt dài 69-80 E1.8 450,0 Nhiều vết kéo vệt
DC:Me (9:1) 81-100 E1.9 23,9 Vết mờ Tổng khối lượng 4254,5
Hiệu suất 65,81%
Phân đoạn E1.2 (45,8 mg) được thực hiện sắc ký cột pha thường nhiều lần với dung mơi rửa giải duy nhất là Hex:DC (2:8), thu được hợp chất ở dạng tinh thể màu cam, kí hiệu là NO01 (10,7 mg). Tiến hành gửi ghi phổ để xác định cấu trúc. Kết quả ghi phổ được trình bày ở Phụ lục 2.
Phân đoạn E2:
Phân đoạn E2 đã được tiếp tục tiến hành sắc ký cột pha thường với các thơng số sau: Đường kính cột: d=3,0 cm.
Chiều dài cột: l=19 cm.
Khối lượng silica gel nhồi cột: 60 g. Khối lượng đoạn E2: 4,4806 g. Dung mơi ổn định cột Hex:DC (4:6).
Hệ dung mơi giải ly ban đầu là Hex:DC (4:6), tăng dần độ phân cực bằng dichloromethane và methanol. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng SKLM, hiện vết bằng đèn UV và thuốc thử vanilline trong H2SO4, gia nhiệt trên bếp điện. Các lọ cho vết giống nhau sẽ được gom chung, cơ đuổi dung mơi thu được 6 phân đoạn ký hiệu là E2.1-E2.6. Quá trình thực hiện được tĩm tắt ở Bảng 4.26.
Bảng 4.26: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E2 Hệ dung mơi
giải ly Số lọ Phân đoạn
Khối lượng
(mg) Kết quả sắc ký lớp mỏng Hex:DC (4:6) 1-4 E2.1 435,0 Vết mờ
Hex:DC (3:7) 5-13 E2.2 3252,7 Vết chính màu nâu, vết phụ kéo vệt dài
Hex:DC (2:8) 13-17 E2.3 225,5 Vết màu nâu nhạt, vết màu vàng nhiều vết mờ DC (100%) 28-28 E2.4 34,9 Vết màu vàng rất mờ
29-31 E2.5 67,9 Vết mờ DC:Me (9:1) 32-35 E2.6 13,7 Vết mờ
Tổng khối lượng 4030,7
Hiệu suất 89,96%
Phân đoạn E2.2 (3252,7 mg) được tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường với dung mơi tích hợp thu được 12 phân đoạn kí hiệu từ E2.2.1-E2.2.12. Kết quả sắc ký cột phân đoạn trên được trình bày trong Bảng 4.27.
Bảng 4.27: Tĩm tắt kết quả sắc ký cột pha thường phân đoạn E2.2 Hệ dung mơi giải ly Số lọ Phân đoạn Khối lượng (mg) Kết quả sắc ký lớp mỏng Hex:DC (5:5) 1-2 E2.2.1 4,2 Vết mờ
3-12 E2.2.2 163,0 Vết chính màu xanh dương (xanh lá, vàng)
13-25 E2.2.3 129,3 Vết màu cam mờ
Hex:DC (4:6)
26-36 E2.2.4 178,6 Vết màu cam, nhiều vết phụ kéo vệt 37-42 E2.2.5 61,5 Vết màu vàng mờ, vết phụ kéo vệt mờ 43-50 E2.2.6 65,6 Vết màu vàng mờ
51-66 E2.2.7 154,1 Vết màu vàng, vết phụ màu nâu Hex:DC (3:7)
67-75 E2.2.8 119,2 Vết mờ
76-80 E2.2.9 596,9 Vết chính màu nâu, vết phụ kéo vệt 81-97 E2.2.10 1277,1 Vết màu nâu, vết phụ màu vàng DC (100%) 98-115 E2.2.11 245,3 Vết màu vàng, vết phụ kéo vệt dài DC:Me (95:5) 116-124 E2.2.12 27,5 Vết mờ, kéo vệt
Tổng khối lượng 3031,3
Hiệu suất 93,19%
Từ phân đoạn E2.2.9, tiếp tục thực hiện sắc ký cột pha thường với hệ dung mơi thích hợp, kết hợp với phương pháp kết tinh lại trong chloroform:methanol thu được tinh thể màu trắng, khối lượng 10,3 mg, được kí hiệu là NO02.
Như vậy, sau quá trình phân lập chất trên mẫu cao phân đoạn ethyl acetate rễ cây Gáo vàng, đã phân lập được hợp chất NO01 cĩ khối lượng 10,7 mg và hợp chất NO02 cĩ khối lượng 10,3 mg. Kết quả hình dạng và sắc ký lớp mỏng của hợp chất NO01, NO02 được trình bày ở Hình 4.9.
A. A. Hình dạng và kết quả SKLM của hợp chất NO01
a. UV 254 nm; b. UV 365 nm;
c. Hiện hình bằng Vanilin/H2SO4; d. Hình dạng, màu sắc (C (100%), DC (100%), Ea (100%))
B. Hình dạng và kết quả SKLM của hợp chất NO02 a. Hiện hình bằng Vanilin/H2SO4; b. Hình dạng, màu sắc
(C:Me (9:1), DC:Me (9:1), Ea:Me (9:1))
Hình 4.9: Hình dạng và kết quả SKLM của 2 hợp chất được phân lập
Hợp chất NO01 và NO02 được ghi các loại phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC và COSY (Phụ lục 2).