Khảo sát độc tính bán trường diễn nhằm mục đích đánh giá độc tính của cao chiết lên các cơ quan nội tạng khi sử dụng điều trị kéo dài. Thời gian thử nghiệm độc tính 90
ngày, với liều cao nhất trong nghiên cứu khả năng bảo vệ gan là 400 mg/kg khối lượng chuột thí nghiệm. Kết quả cho thấy, chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg vẫn hoạt động bình thường. Về sự gia tăng khối lượng chuột sau thí nghiệm, tuy cĩ phần gia tăng khối lượng ít hơn so với nhĩm đối chứng bình thường nhưng khác biệt khơng nhiều và nhìn chung chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg chuột vẫn tăng khối lượng đều (Phụ lục 1.3).
4.5.2.1 Ảnh hưởng của cao chiết rễ Gáo vàng đến một số chỉ tiêu sinh hĩa và chỉ tiêu huyết học chuột
Ảnh hưởng của cao chiết rễ Gáo vàng lên một số chỉ tiêu sinh hĩa chuột được trình bày ở Bảng 4.16. Số liệu cho thấy, nhĩm chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg sau 90 ngày cĩ hàm lượng glucose huyết (12,6±1,14 mmol/L) tương tự với nhĩm bình thường (12,2±3,27 mmol/L). Hay nĩi cách khác hàm lượng glucose huyết của nhĩm chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng và nhĩm chuột bình thường khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05). Như vậy, sử dụng cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg liên tục 90 ngày xem là khơng ảnh hưởng xấu đến hàm lượng glucose huyết.
Gan là cơ quan trung tâm của quá trình trao đổi chất, trong trường hợp gan bị tổn thương hàm lượng enzyme ALT và AST sẽ tăng lên (Gatsing et al., 2005). Do đĩ, xác định hàm lượng ALT và AST trong huyết thanh đã cung cấp cơ sở chính xác để đánh giá chức năng gan (Ulican et al., 2003; Porchezhian and Ansari, 2005). Kết quả nghiên cứu cho thấy, chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng cĩ hàm lượng AST (178,4±73,84 U/L) khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường (238,2±69,14 U/L). Trong khi, hàm lượng ALT ở chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng (56,6±36,57 U/L) được xem là khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với chuột bình thường (37,6±20,77 U/L). Kết quả này cho thấy hàm lượng cả hai loại enzyme ALT và AST ở chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng khơng khác biệt so với chuột bình thường. Như vậy, cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg sử dụng trong 90 ngày khơng ảnh hưởng xấu đến chức năng gan.
Thận cũng là một cơ quan trong cơ thể quan trọng khơng kém so với gan. Thận tham gia vào quá trình bài tiết chất thải như thuốc và các chất chuyển hĩa thứ cấp. Khi thận tiếp xúc với một số chất độc hại cĩ thể làm hỏng ống thận (Bayomy et al., 2017). Các chỉ tiêu urea và creatinine thường được sử dụng trong chẩn đốn tình trạng của thận. Sự gia tăng hàm lượng urea và creatinine là dấu hiệu cho thấy thận đã bị ảnh hưởng đến chức năng lọc của thận (Ashafa et al., 2009). Kết quả nghiên cứu cho thấy, chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng cĩ hàm lượng urea và creatinine lần lượt là 3,12±1,02 mmol/L; 50±7,07 mmol/L, tương đương với chuột bình thường (urea=4,08±1,66; creatinine=54±5,48 mmol/L). Hàm lượng urea và creatinine của chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng khác biệt
khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê so với chuột bình thường (p<0,05). Các phân tích chỉ ra rằng, cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg sử dụng trong 90 ngày khơng ảnh hưởng xấu đến chức năng thận.
Bảng 4.16: Một số chỉ tiêu sinh hĩa ở chuột thử độc tính bán trường diễn
Chỉ tiêu Nghiệm thức
Bình thường Rễ gáo vàng
Glucose huyết (mmol/L) 12,2±3,27a 12,6±1,14a
Gan AST (U/L) 238,2±69,14a 178,4±73,84a ALT (U/L) 37,6±20,77a 56,6±36,57a Thận Urea (mmol/L) 4,08±1,66a 3,12±1,02a Creatinin (mmol/L) 54±5,48a 50±7,07a Lipid huyết Cholesterol (mmol/L) 3,5±0,71a 2,8±0,84b Triglycerid (mmol/L) 1,72±0,85a 0,82±0,31a HDL cholesterol (mmol/L) 1,02±0,08a 0,82±0,13b LDL cholesterol (mmol/L) 2,1±0,42a 1,6±0,66a
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=5; Các giá trị cĩ các chữ cái theo sau trong cùng một hàng giống nhau sẽ khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Các chỉ tiêu lipid huyết chuột cũng đã được khảo sát gồm: cholesterol, triglycerid, HDL cholesterol và LDL cholesterol. Số liệu ở Bảng 4.16 cũng cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng được xem là cĩ tác dụng điều hịa lipid huyết ở chuột bình thường khi làm giảm được hàm lượng cholesterol, triglycerid và LDL cholesterol thấp hơn chuột bình thường lần lượt là 1,25; 2,10 và 1,31 lần. Điều này cĩ thể giải thích là do rễ Gáo vàng cĩ chứa polyphenol và flavonoid cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa nên làm giảm mức độ cholesterol xấu và ngăn chặn quá trình oxy hĩa chất béo. Điều này phù hợp với kết luận của Gặlle et al. (2020), Cà chua cĩ chứa một số chất kháng oxy hĩa như polyphenol, lycopene, các nguyên tố vi lượng và vitamin cĩ thể ức chế quá trình xơ vữa động mạch. Như vậy, cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg sử dụng trong 90 ngày khơng ảnh hưởng xấu đến hàm lượng lipid huyết ở chuột bình thường.
Trong nghiên cứu độc tính, việc phân tích các chỉ số trong cơng thức máu đĩng vai trị quan trọng, các chỉ số sẽ phản ánh tình trạng sức khỏe của động vật thí nghiệm. Trong nghiên cứu này thành phần cơng thức máu của chuột thử nghiệm được đánh giá dựa trên 14 chỉ số. Nghiên cứu đã phân tích và so sánh các chỉ số trong cơng thức máu ở các nhĩm chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng với cơng thức máu của nhĩm chuột bình thường (Bảng 4.17).
Bảng 4.17: Một số chỉ tiêu huyết học của chuột thử nghiệm Chỉ tiêu Nhĩm thí nghiệm Bình thường Rễ gáo vàng WBC (103/mm3) 6,36±0,95b 10,1±0,98a LYM (%) 78,7±6,6b 86,8±4,19a MON (%) 7,42±3,9a 5,48±1,12a NEU (%) 7,78±3,12a 4,82±2,28a RBC (%) 9,68±0,78a 10,5±0,75a HGB (g/dL) 14,9±0,66a 15,8±1,57a HCT (%) 49,1±1,17a 51,7±5,09a MCV (µm3) 50,8±3,42a 49±1,41a MCH (pg) 15,4±0,64a 14,9±0,56a MCHC (g/dL) 30,3±1,02a 30,6±0,36a RDW (%) 13,6±1,48a 14,6±1,07a PLT (103/mm3) 885±162,1a 808±105a MPV (µm3) 5,78±0,25a 5,62±0,16a PCT (%) 0,51±0,09a 0,45±0,06a
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=5; Các giá trị cĩ các chữ cái theo sau trong cùng một hàng giống nhau sẽ khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%.WBC-Số lượng bạch cầu trong một thể tích máu; NEU- Bạch cầu trung tính; LYM-Bạch cầu Lympho; MON-Bạch cầu Mono; RBC-Số lượng hồng cầu trong một thể tích máu; HGB-Lượng huyết sắc tố trong một thể tích máu; PLT-Số lượng tiểu cầu trong một thể tích máu; HCT-Thể tích khối hồng cầu; MCV-Thể tích trung bình hồng cầu; MCH-Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu; MCHC-Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu; MPV-Thể tích trung bình tiểu cầu; PCT-Thể tích khối tiểu cầu; RDW-Độ phân bố hồng cầu.
Số liệu ở Bảng 4.17 cho thấy, cao chiết rễ Gáo vàng khơng ảnh hưởng đến các chỉ số bạch cầu lympho, bạch cầu mono, bạch cầu trung tính, số lượng hồng cầu trong một thể tích máu, lượng huyết sắc tố trong một thể tích máu, thể tích khối hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu, nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu, độ phân bố hồng cầu và thể tích trung bình tiểu cầu, khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê so với nhĩm chuột bình thường (p>0,05). Trong khi đĩ, cao chiết rễ Gáo vàng cĩ số lượng tiểu cầu trong một thể tích máu, thể tích khối tiểu cầu tương đương với nhĩm chuột bình thường (p>0,05). Bạch cầu là dịng bảo vệ tế bào đầu tiên đáp ứng với các tác nhân truyền nhiễm, tổn thương mơ hoặc quá trình viêm. Cao chiết rễ Gáo vàng làm tăng đáng kể số lượng bạch cầu trong một thể tích máu và tăng bạch cầu lympho. Điều này là do sự hiện diện của saponin, flavonoid và alkaloid giúp tăng cường chức năng miễn dịch kích thích sự phân chia và tăng số lượng bạch cầu (Kumolosasi et al., 2018). Dựa trên kết quả phân tích cơng thức máu của nhĩm chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg so với nhĩm chuột bình thường cĩ thể nhận thấy cao chiết rễ Gáo vàng khơng cĩ ảnh hưởng xấu đến cơng thức máu mà cịn cĩ tác động tích cực đến cơng thức máu của chuột thử nghiệm khi làm tăng cường chức năng miễn dịch kích thích sự phân chia và tăng số lượng bạch cầu.
4.5.2.2 Ảnh hưởng của cao chiết rễ Gáo vàng lên mơ học một số nội tạng chuột
Sau 90 ngày theo dõi, tất cả chuột thử nghiệm vẫn cịn sống và hoạt động bình thường, chuột được giải phẩu thu lấy gan, thận, lách và ruột để khảo sát mơ học. Độc tính bán trường diễn của cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg thể hiện qua sự thay đổi trên cấu trúc mơ học của các cơ quan như gan, thận, lách và ruột được so sánh với cấu trúc mơ học bình thường trong Hình 4.7.
So với cấu trúc mơ gan bình thường (Hình 4.7A-B), ở nồng độ 400 mg/kg rễ Gáo vàng cĩ ảnh hưởng nhẹ đến cấu trúc mơ học. Kết quả mơ học ở nhĩm uống rễ Gáo vàng cho thấy các tế bào gan bình thường cĩ nhân hình cầu chiếm số lượng lớn, tế bào chất đều màu cho thấy cĩ sự tương phản với nhân tế bào, xoang gan tương tự cấu trúc bình thường. Tuy nhiên, mơ gan cĩ sự xuất hiện của số ít tế bào viêm và tế bào nhân tan. Qua 90 ngày theo dõi, tỷ lệ chuột sống là 100%, các kết quả sinh hĩa (enzyme AST và ALT) của chuột vẫn ở mức bình thường. Như vậy, chuột uống cao chiết rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg/ngày kéo dài 90 ngày cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng vẫn thể hiện tính an tồn cho gan.
Hình 4.7: Vi phẫu một số nội tạng chuột thử độc bán trường diễn
A: gan bình thường; B: gan nhĩm uống rễ Gáo vàng 400 mg/kg; C: thận bình thường; D: thận nhĩm uống rễ Gáo vàng 400 mg/kg; E: lách nhĩm bình thường; F: lách nhĩm uống rễ Gáo vàng 400 mg/kg; G: ruột nhĩm bình thường;
H: ruột nhĩm uống rễ Gáo vàng 400 mg/kg (nhuộm hematoxylin và eosin, độ phĩng đại ×400).
Chuột uống cao chiết liều 400 mg/kg khối lượng cĩ cấu trúc mơ học của thận gần như bình thường (Hình 4.7C-D), cĩ thể dễ dàng phân tích được các cấu trúc đặc trưng của
ống thận gồm tiểu cầu thận, xoang Bownman, ống lượn gần, ống lượn xa. Cao chiết rễ Gáo vàng ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng chuột hầu như khơng cĩ sự ảnh hưởng lớn đến đến cấu trúc mơ lách (Hình 4.7E-F). So với cấu trúc lách bình thường, mơ lách chuột uống rễ Gáo vàng liều 400 mg/kg vẫn được xác định rõ động mạch trung tâm, nang bạch huyết, lympho B. Nhìn chung, cao chiết rễ Gáo vàng ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng chuột chỉ làm thay đổi cấu trúc mơ học lách ở mức độ nhẹ, theo các thơng số huyết học đo được thì chức năng của lách vẫn bình thường.
Kết quả phân tích mơ học ruột của chuột thử nghiệm cho thấy (Hình 4.7G-H), cao chiết ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng chuột cấu trúc mơ ruột khơng cĩ sự thay đổi so với cấu trúc mơ học bình thường. Cấu trúc mơ học ở 2 nghiệm thức cho kết quả tương đương nhau, chưa nhận thấy được sự thay đổi cấu trúc ở bất kì vị trí nào thể hiện trên lát cắt.
Nhìn chung, thử nghiệm độc tính bán trường diễn được thực hiện trong thời gian 90 ngày cho thấy, cao chiết rễ Gáo vàng ở nồng độ 400 mg/kg khối lượng chuột vẫn giữ được tính an tồn khi sử dụng. Cao chiết hầu như khơng cĩ ảnh hưởng đến cấu trúc mơ thận và mơ ruột. Cĩ sự thay đổi nhẹ về cấu trúc, cĩ xuất hiện một số tế bào viêm trong vi thể mơ gan và mơ lách. Đây cĩ thể là sự phản ứng rất bình thường của cơ thể động vật khi uống cao chiết liên tục nhiều ngày. Tuy nhiên, kết hợp với sự gia tăng khối lượng và các chỉ tiêu sinh hĩa cho thấy cao chiết rễ Gáo vàng cĩ thể được xem như khơng gây độc cho cơ thể chuột.
4.6 Chiết cao phân đoạn và thử hoạt tính sinh học các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
4.6.1 Chiết cao phân đoạn từ cao tổng rễ Gáo vàng
Cao tổng methanol rễ Gáo vàng được chiết phân đoạn lần lượt với dung mơi n- hexane và ethyl acetate. Hiệu suất chiết cao phân đoạn n-hexane là 36,48% và ethyl acetate là 38,51% (lượng cao nước thu được rất ít nên khơng tính hiệu suất).
4.6.2 Khả năng kháng oxy hĩa của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng
Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng được xác định và trình bày ở Bảng 4.18. Số liệu ở Bảng 4.18 cho thấy, phân đoạn n- hexane cĩ hàm lượng polyphenol tổng (34,20,19 mg GAE/g cao chiết), flavonoid tổng (87,91,18 mg QE/g cao chiết) và alkaloid tổng (284,2±3,6 mg AE/g cao chiết) thấp nhất trong khi cao phân đoạn ethyl acetate cĩ hàm lượng polyphenol tổng (45,10,19 mg GAE/g cao chiết), flavonoid tổng (116,72,66 mg QE/g cao chiết) và alkaloid tổng (989,8±9,64 mg AE/g cao chiết) cao nhất trong 3 loại cao.
Bảng 4.18: Hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Hàm lượng Cao chiết rễ Gáo vàng
Methanol n-Hexane Ethyl acetate Polyphenol tổng (mg GAE/g) 38,20,2b 34,20,19c 45,10,19a
Flavonoid tổng (mg QE/g) 104,11,6b 87,91,18c 116,72,66a
Alkaloid tổng (mg AE/g) 895,4±18,1b 284,2±3,6c 989,8±9,64a
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một hàng giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% (p<0,05)
Khả năng kháng oxy hĩa của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Hơn nữa, kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hĩa bằng 3 phương pháp bao gồm trung hịa gốc tự do DPPH, khả năng khử sắt (RP) và phosphomolybdenum (kháng oxy hĩa tổng-TAC) của cao methanol và các cao phân đoạn rễ Gáo vàng (Bảng 4.19) cho thấy rằng cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng cĩ khả năng kháng oxy hĩa cao nhất với hoạt động trung hịa gốc tự do DPPH (EC50=39,8±0,53 µg/mL), khả năng khử sắt (EC50=169,2±3,4 µg/mL) và khả năng kháng oxy hĩa tổng (EC50=33,9±0,03 µg/mL) cao nhất. Cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng cĩ EC50 trong 3 thử nghiệm kháng oxy hĩa đều thấp hơn cao methanol lần lượt 1,8 , 2,2 và 1,8 lần cho thấy cao methanol cĩ khả năng kháng oxy hĩa thấp hơn cao phân đoạn ethyl acetate và khả năng kháng oxy hĩa thấp nhất là cao phân đoạn n-hexane.
Bảng 4.19: EC50 của các cao phân đoạn rễ gáo vàng trong các thử nghiệm kháng oxy hĩa
Cao chiết/ chất chuẩn EC50 (µg/mL)
DPPH RP TAC
Methanol rễ Gáo vàng 73,4±1,25b 375,9±25,39b 61,2±0,27b
n-Hexane rễ Gáo vàng 93,4±1,97a 633,1±6,2a 98,4±1,72a Ethyl acetate rễ Gáo vàng 39,8±0,53c 169,2±3,4c 33,9±0,03c
Vitamin C 18,3±0,33d 67,0±0,68d 0,55±0,01d
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% .
Khả năng kháng viêm của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Các cao phân đoạn rễ gáo vàng cũng được thử hoạt tính kháng viêm thơng qua hoạt động ức chế sự biến tính protein BSA, kết quả được trình bày trong Bảng 4.20. Hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSA của các cao chiết được khảo sát từ nồng độ 0,78125 đến 25 µg/mL cao chiết, kết quả ở Bảng 4.20 cho thấy, hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSA thấp nhất là cao n-hexane (4,37±0,88%) ở nồng độ 0,78125 µg/mL và hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSA cao nhất là cao ethyl acetate (83,2±1,53%) ở nồng độ 25 µg/mL. Nếu xét ở từng nồng độ được khảo sát, cao n-hexane cĩ hiệu suất ức chế sự biến
tính protein BSA thấp nhất, tiếp theo là cao methanol và cao ethyl acetate cĩ hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSA cao nhất.
Bảng 4.20: Hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSAcủa các cao phân đoạn rễ Gáo vàng Nồng độ (µg/mL) Hiệu suất ức chế sự biến tính protein BSA (%)
Cao methanol Cao n-hexane Cao ethyl acetate
0,78125 11,5±1,53f 4,37±0,88f 20,4±1,84f 1,5625 16,0±1,53e 8,44±1,53e 25,0±1,55e 3,125 24,7±2,33d 13,0±1,53d 28,8±0,84d 6,25 30,3±1,76c 16,5±0,88c 38,5±0,93c 12,5 45,0±1,53b 31,3±1,53b 51,1±1,6b 25 71,5±3,18a 56,2±0,88a 83,2±1,53a
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5% (p<0,05).
Nồng độ của các cao chiết phân đoạn rễ Gáo vàng khi đạt được hiệu suất ức chế 50% protein BSA (EC50) cũng được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của từng cao và trình bày trong Bảng 4.21. Ngồi ra, EC50 của các cao chiết cũng được so sánh với EC50 của chất đối chứng dương diclofenac (0,66±0,09 µg/mL). Số liệu ở Bảng 4.21 cho thấy, EC50 của cao n-hexane (21,8±0,13 µg/mL) là cao nhất và cao gấp khoảng 33 lần so với