Hình thái gan chuột thử nghiệm
Quan sát đại thể gan chuột thử nghiệm (Hình 4.8) cũng cho thấy nhĩm uống CCl4 và cao phân đoạn n-hexane rễ Gáo vàng cĩ gan tái nhạt và bề mặt cịn gồ ghề. Nhĩm uống CCl4 và cao phân đoạn methanol cĩ bề mặt gan cải thiện đáng kể so với đối chứng bệnh nhưng màu gan cịn tái nhạt. Trong khi nhĩm uống CCl4 và cao phân đoạn ethyl acetate
cĩ gan màu đỏ sậm, độ láng mịn tương đương nhĩm điều trị với silymarin và gần giống với gan nhĩm đối chứng bình thường.
Hình 4.8: Hình thái gan chuột thử nghiệm với các cao phân đoạn rễ Gáo vàng A: Bình thường; B: CCl4; C: CCl4+silymarin 16 mg/kg; D: CCl4+cao methanol rễ Gáo vàng 200; E:
CCl4+cao n- hexane rễ Gáo vàng 200; F: CCl4+cao ethyl acetate rễ Gáo vàng 200
Thơng qua việc xác định hàm lượng AST và ALT huyết thanh, MDA và GSH trong gan của chuột thí nghiệm cĩ thể xác định được mức độ tổn thương của gan cũng như khả năng bảo vệ gan của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng.
Hàm lượng enzyme AST và ALT trong huyết thanh
Số liệu trình bày ở Bảng 4.22 cho thấy cĩ sự khác biệt đáng kể trong các chỉ số enzyme gan AST và ALT giữa nhĩm chuột đối chứng bệnh và nhĩm chuột đối chứng bình thường. Hàm lượng AST của nhĩm chuột đối chứng bệnh và nhĩm chuột bình thường đo được lần lượt là 1533,8±346,3 U/L và 159,8±12,8 U/L; hàm lượng ALT đo được lần lượt là 970,2±311,4 U/L và 31,8±9,8 U/L. Từ đây cho thấy khi chuột uống CCl4
kéo dài 4 tuần thì hàm lượng enzyme AST tăng cao gấp 9 lần và ALT tăng gấp 30 lần so với nhĩm chuột đối chứng bình thường, chứng tỏ chuột uống CCl4 đã bị nhiễm độc gan. Ở nhĩm chuột uống DMSO 1% đo được hàm lượng AST là 156,2±32,2 U/L và ALT là 71,8±18,4 U/L, so với nhĩm chuột đối chứng bình thường thì hàm lượng AST và ALT ở hai nhĩm này khác biệt khơng cĩ ý nghĩa, cho thấy việc sử dụng DMSO 1% làm dung mơi pha cao chiết trong thí nghiệm khơng ảnh hưởng đến giá trị enzyme AST và ALT trong máu chuột. Ở nhĩm chuột uống CCl4 được điều trị bằng silymarin hàm lượng AST đo được trong huyết thanh là 307,2±52,8 U/L và ALT là 114,4±26,7 U/L, khi so với hàm lượng AST và ALT của nhĩm chuột đối chứng bệnh thì silymarin liều 16 mg/kg đã làm
giảm được 80% lượng AST và 96% ALT. Kết quả cho thấy silymarin đã ức chế được tác hại CCl4, bảo vệ được tế bào gan.
Bảng 4.22: Hàm lượng enzyme AST và ALT của các nhĩm chuột thử nghiệm với các cao rễ Gáo vàng
Nhĩm thí nghiệm Hàm lượng enzyme (U/L)
AST ALT
Bình thường 159,8±12,8c 31,8±9,8c
Olive, DMSO 1% 156,2±32,2c 71,8±18,4c
CCl4 1533,8±346,3a 970,2±311,4a
CCl4, silymarin 16 mg/kg 307,2±52,8bc 114,4±26,7c
CCl4, cao methanol rễ Gáo vàng 200 mg/kg 302,6±85,4bc 168,4±51,6c CCl4, cao n-hexane rễ Gáo vàng 200 mg/kg 446±28,8b 485,8±205b CCl4, cao ethyl acetate rễ Gáo vàng 200 mg/kg 132±27,3c 58±18c
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=5; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Chuột được gây nhiễm độc gan bằng CCl4 và điều trị bằng các cao chiết phân đoạn từ rễ Gáo vàng cĩ mức enzyme AST và ALT trong huyết thanh đã giảm rõ rệt so với nhĩm đối chứng bệnh. Ở liều 200 mg/kg khối lượng chuột, các cao chiết được khảo sát đều cho kết quả làm giảm hàm lượng enzyme AST và ALT ở các nhĩm chuột thí nghiệm khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bệnh. Nhĩm chuột uống CCl4 và cao methanol rễ Gáo vàng 200 mg/kg cĩ hàm lượng enzyme AST (302,6±85,4 U/L) và ALT (168,4±51,6 U/L) tương đương nhĩm điều trị với silymarin. Nhĩm uống CCl4 và cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng 200 mg/kg cĩ hàm lượng enzyme AST (132±27,3 U/L) và (ALT 58±18 U/L) tương đương nhĩm đối chứng bình thường. Ở nhĩm chuột uống CCl4 và cao phân đoạn n-hexane rễ Gáo vàng 200 mg/kg cĩ hàm lượng enzyme AST và ALT vẫn cịn cao, tuy nhiên AST (446±28,8 U/L) thấp hơn ở nhĩm đối chứng bệnh 3,4 lần và ALT (485,8±205 U/L) thấp hơn ở nhĩm đối chứng bệnh 2 lần, khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với đối chứng bệnh. Kết quả cho thấy cao phân đoạn ethyl acetate cĩ khả năng làm giảm enzyme AST và ALT tốt nhất.
Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột thử nghiệm với các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột thử nghiệm cũng được phân tích trình bày trong Bảng 4.23. Số liệu ở Bảng 4.23 cho thấy, nhĩm chuột đối chứng bệnh cĩ hàm lượng MDA tăng khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê trong khi hàm lượng GSH giảm cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bình thường. Sự thay đổi hàm lượng MDA và GSH là do sự stress oxy hĩa và peroxide hĩa lipid xảy ra mạnh mẽ ở gan.
Bảng 4.23: Hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột thử nghiệm với các cao phân đoạn rễ Gáo vàng
Nhĩm thí nghiệm Hàm lượng (nM/g mơ)
MDA GSH
Bình thường 1,62±0,05ef 530,3±79,3e
Olive, DMSO 1% 1,47±0,08f 485,1±46,7e
CCl4 18,7±0,24a 133,2±12,7f
CCl4, silymarin 16 mg/kg 1,88±0,18d 945,2±13,4c
CCl4, cao methanol rễ Gáo vàng 200 mg/kg 2,79±0,03c 1083,5±10,4b CCl4, cao n-hexane rễ Gáo vàng 200 mg/kg 5,39±0,17b 633±22,4d CCl4, cao ethyl acetate rễ Gáo vàng 200 mg/kg 1,76±0,26de 1600,5±14,4a
Ghi chú: Các giá trị trình bày là mean±SEM, n=3; Các giá trị cĩ mẫu tự theo sau trong cùng một cột giống nhau thì khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Ở các nhĩm điều trị với các cao rễ Gáo vàng liều 200 mg/kg (cao methanol, cao phân đoạn n-hexane hoặc cao phân đoạn ethyl acetate) và silymarin đã cải thiện trạng thái stress oxy hĩa và peroxide hĩa lipid ở gan theo xu hướng làm giảm MDA và làm tăng GSH. Ở nhĩm sử dụng cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng liều 200 mg/kg kết quả đạt được tương tự hoặc tốt hơn silymarin liều 16 mg/kg. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hố của các cao phân đoạn rễ Gáo vàng ở Bảng 4.19 cho thấy, khả năng kháng oxy hĩa của cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng cao hơn cao methanol rễ Gáo vàng và cao n-hexane. Hơn nữa, khả năng kháng viêm của cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng (ở Bảng 4.21) cũng cao hơn cao methanol rễ Gáo vàng và cao phân đoạn n-hexane rễ Gáo vàng lần lượt là 1,3 và 1,9 lần.
Các cao chiết thực vật thường chứa nhiều chất kháng oxy hĩa và các hợp chất cĩ khả năng làm sạch gốc tự do. Đồng thời, các hợp chất polyphenol và flavonoid ở thực vật đã được chứng minh cĩ liên quan với các hoạt động kháng oxy hĩa (Aryal et al., 2019). Kết quả nghiên cứu ở Bảng 4.18, các cao phân đoạn rễ Gáo vàng cĩ thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng khá cao. Đặc biệt cao phân đoạn ethyl acetate cĩ thành phần polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng cao hơn các cao cịn lại. Chính vì vậy cao phân đoạn ethyl acetate cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa cao hơn các cao methanol và cao
n-hexane. Bên cạnh đĩ, các gốc tự do được biết là tác nhân trung gian gây ra chứng viêm và hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất kháng oxy hĩa cũng đã được ghi nhận. Do đĩ, các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa xem như nguồn hợp chất tiềm năng để điều trị chứng viêm. Theo Lee et al. (2015), hoạt động kháng oxy hĩa làm sạch gốc tự do cĩ thể chịu trách nhiệm cho hoạt động kháng viêm của cao chiết. Vì vậy, cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa tốt thì cũng cĩ khả năng kháng viêm tốt hơn cao methanol rễ Gáo vàng và cao phân đoạn n-hexane rễ Gáo vàng.
Carbon tetrachloride (CCl4) được biết là tác nhân gây độc gan và đặc trưng của sự nhiễm độc gan do CCl4 là gan nhiễm mỡ, xơ gan và hoại tử (Huo et al., 2011). Sự biến đổi sinh học CCl4 sinh ra các gốc tự do phản ứng cao. Các gốc tự do cĩ thể gĩp phần vào sự khởi phát và làm tiến triển xơ hĩa trong gan (Poli, 2000). Do đĩ, mơ hình gây nhiễm độc gan bằng CCl4 được sử dụng như mơ hình thử nghiệm gây tổn thương gan để sàng lọc các loại cao chiết hoặc thuốc bảo vệ gan (Refaey et al., 2015). Cho chuột uống CCl4 (2,5 ml/ kg, 20% CCl4 trong dầu olive) khơng gây chết và khơng ảnh hưởng đến hành vi chung và khối lượng cơ thể. Giai đoạn đầu uống CCl4, chuột bị lừ đừ ít hoạt động và ăn ít, nhưng sau một tuần chuột hoạt động bình thường sau mỗi lần uống và vẫn tăng khối lượng. Hơn nữa, sự gia tăng khối lượng cơ thể chuột cũng do sự gia tăng khối lượng gan do sự xâm nhập của các acid béo và glycerol vào tế bào gan qua màng tế bào bị tổn thương gây ra sự trương phồng tế bào và hoại tử tế bào gan dẫn đến sự thay đổi hình thái gan (Hình 4.9B). Những thay đổi này đã được nhiều tác giả báo cáo do tác hại của CCl4
(Huang et al., 2012; Das et al., 2014; Simeonova et al., 2014).
Nồng độ các enzyme transaminase trong huyết thanh là dấu hiệu quan trọng để xác định mức độ nghiêm trọng của sự tổn thương gan. Chuột được gây bệnh với CCl4 làm tăng đáng kể hàm lượng enzyme ALT và AST trong huyết thanh cho thấy gan đã tổn thương (Kandimalla et al., 2016). Kết quả ở Bảng 4.22 cho thấy, ở nhĩm đối chứng bệnh hàm lượng enzyme gan AST và ALT cao khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm chuột đối chứng bình thường. Trong thí nghiệm này, chuột uống CCl4 kéo dài 4 tuần thì hàm lượng enzyme ALT tăng 30 lần so với chuột bình thường, chứng tỏ chuột uống CCl4
đã bị tổn thương gan. Hàm lượng enzyme ALT và AST trong huyết thanh ở chuột tổn thương gan giảm cĩ ý nghĩa thống kê khi sử dụng thêm silymarin hoặc các cao phân đoạn rễ Gáo vàng. Nhĩm chuột bệnh được điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg cĩ hàm lượng AST và ALT lần lượt đo được trong huyết thanh vẫn cịn cao hơn đối chứng sinh lý nhưng so với nhĩm chuột đối chứng bệnh thì silymarin liều 16 mg/kg cĩ hiệu suất làm giảm enzyme AST đạt 92,72±11,05% và ALT đạt 91,07±3,02%. Từ đĩ, cĩ thể thấy silymarin liều 16 mg/kg đã ức chế được tác hại CCl4, bảo vệ được gan chuột thí nghiệm. Các nghiên cứu trước đây cho thấy silymarin cĩ khả năng bảo vệ gan khỏi tổn thương do CCl4 gây ra (Refaey et al., 2015; Duong et al., 2016). Silymarin cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa, kháng viêm và proapoptotic cĩ thể ngăn chặn sự khởi đầu và tiến triển của các cơ chế gây tổn thương phát triển viêm gan thành xơ gan và ung thư gan (Federico et al., 2017). Các cao rễ Gáo vàng cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa và kháng viêm nên cĩ khả năng bảo vệ gan. Kết quả ở Bảng 4.22 đã chứng minh, các nhĩm chuột bệnh được điều trị bằng các cao phân đoạn rễ Gáo vàng ở nồng độ 200 mg/kg cĩ mức enzyme AST và ALT trong huyết thanh được cải thiện rõ rệt so với đối chứng bệnh. Nhĩm chuột bệnh được điều trị
bằng cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng liều 200 mg/kg cĩ hàm lượng AST và ALT tương đương với nhĩm đối chứng bình thường. Cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng thể hiện khả năng làm giảm AST và ALT huyết thanh rất tốt.
Peroxide hĩa lipid là một trong những đặc điểm chính của sự nhiễm độc gan gây ra do CCl4. MDA là sản phẩm peroxide hĩa lipid, được hình thành bởi các gốc tự do tấn cơng màng tế bào và được sử dụng rộng rãi như là một dấu chuẩn sinh học về sự tổn thương peroxide hĩa lipid (Simeonova et al., 2014). Tác nhân bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm giảm được hàm lượng MDA trong mơ gan (Tsai et al., 2017). Kết quả nghiên cứu ở Bảng 4.23 cho thấy, nhĩm đối chứng bệnh cĩ hàm lượng MDA (18,7±0,24 nM MDA/g mơ) cao gấp 8,26 lần và khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bình thường (1,62±0,05 nM MDA/g mơ). Sự gia tăng mức MDA ở gan cho thấy sự gia tăng peroxide hĩa lipid, do đĩ dẫn đến tổn thương gan cũng như sự hoạt động kém hiệu quả của hệ thống bảo vệ kháng oxy hĩa. Tuy nhiên, mức MDA tăng được làm giảm sau khi điều trị bằng silymarin hoặc các cao rễ Gáo vàng. Hàm lượng MDA ở các nhĩm được điều trị bằng các cao rễ Gáo vàng giảm khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm đối chứng bệnh. Nhĩm điều trị với cao phân đoạn ethyl acetate nồng độ 200 mg/kg cĩ hàm lượng MDA (1,76±0,26 nM MDA/g mơ) đã giảm 10 lần so với nhĩm đối chứng bệnh và khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê so với nhĩm điều trị bằng silymarin liều 16 mg/kg (1,88±0,18 nM MDA/ g mơ).
Glutathione (L-γ-glutamyl-L-cysteinylglycine) là nhĩm thiol nội bào phổ biến nhất, với nồng độ nội bào từ khoảng 500 đến 10000 nmol. Ở dạng khử, glutathione (GSH) là một chất kháng oxy hố đĩng vai trị quan trọng trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, làm giảm chất oxy hĩa nội sinh và chống stress oxy hố ngoại sinh (Yuan and Kaplowitz, 2009; Enns and Cowan, 2017). Gây tổn thương gan bằng CCl4 làm giảm GSH trong gan và các chất bảo vệ gan hiệu quả sẽ làm phục hồi hàm lượng GSH trong mơ gan (Lu et al., 2017). Qua kết quả nghiên cứu ở Bảng 4.23, hàm lượng GSH của nhĩm chuột đối chứng bệnh (133,2±12,70 nM GSH/g mơ) thấp hơn nhĩm đối chứng sinh lý (530,3±79,30 nM GSH/g mơ) là 3,98 lần. Ở nhĩm chuột gây bệnh được điều trị bằng silymarin đã phục hồi đáng kể mức GSH trong gan. Các nhĩm chuột gây bệnh được điều trị bằng các cao rễ Gáo vàng cĩ hàm lượng GSH tăng rõ rệt so với nhĩm đối chứng bệnh. Ở nhĩm điều trị với cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng đã cĩ thể điều hịa tăng hàm lượng GSH (1600,5±14,40 nM GSH/g mơ) cao gấp 3 lần hàm lượng GSH của nhĩm đối chứng bình thường và cao hơn nhĩm điều trị bằng silymarin liều16 mg/kg (945,2±13,40 nM GSH/g mơ) là 1,4 lần.
Stress oxy hĩa đĩng một vai trị quan trọng trong sự phát triển tổn thương gan. Stress oxy hĩa kéo dài thể hiện sự gia tăng quá trình peroxide hĩa lipid và suy giảm trạng thái kháng oxy hĩa, cũng là những sự kiện thường gặp trong quá trình phát triển của bệnh xơ hĩa gan. Liệu pháp sử dụng chất kháng oxy hĩa, bằng cách loại bỏ gốc tự do trực tiếp hoặc bằng cách tăng cường hệ thống kháng oxy hĩa nội sinh, đã được chứng minh cĩ hiệu quả trong hầu hết các trường hợp ngăn ngừa hoặc làm giảm xơ hĩa gan. Do đĩ, làm giảm các gốc tự do trong nhu mơ gan được đề xuất như một chiến lược điều trị tiềm năng phù hợp, an tồn và rẻ tiền chống lại chứng xơ hĩa gan (Ramos-Tovar and Muriel, 2020)
Thực nghiệm cho thấy rằng CCl4 gây ra sự suy giảm đáng kể hàm lượng GSH, và tăng peroxide hĩa lipid (MDA) ở gan. Trong khi đĩ, việc sử dụng cao chiết thực vật bảo vệ được hệ thống kháng oxy hĩa của gan, ngăn chặn sự gia tăng mức MDA và cải thiện mức độ GSH trong gan. Đặc tính kháng oxy hĩa của cao chiết cĩ thể là cơ chế chính bảo vệ chống lại nhiễm độc gan gây ra do CCl4. Hoạt động kháng oxy hĩa của cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng được xác định bởi hoạt động trung hịa gốc tự do DPPH, hoạt động khử sắt, hoạt động kháng oxy hĩa bằng phương pháp phosphomolypdenum thơng qua việc các gốc tự do nhận nguyên tử H+ hoặc nhận electron từ chất kháng oxy hĩa. Nghiên cứu hiện tại cho thấy cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng thể hiện hoạt động kháng oxy hĩa mạnh trong các phương pháp DPPH, khử sắt và phosphomolybdenum. Ngồi ra việc định lượng thành phần alkaloid, polyphenol và flavonoid tổng đã chứng minh hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tổng kể cả alkaloid tổng trong cao phân đoạn ethyl acetate rễ Gáo vàng cao hơn cao chiết phân đoạn n-hexane và cao methanol rễ Gáo vàng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng cĩ liên quan đến hoạt tính kháng oxy hĩa của các cao chiết thực vật. Cao chiết cĩ hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng cao dẫn đến hoạt động kháng oxy hĩa mạnh hơn, ức chế