Pha dung dịch cao chiết: Mỗi loại cao chiết được cân 0,1 gram cho vào 1000 µL methanol, khuấy cho cao chiết tan hồn tồn trong dung dịch, tiến hành ly tâm mẫu 3000 vịng/ phút trong 5 phút để loại bỏ phần cặn. Đây là các dung dịch cao chiết dùng cho các thí nghiệm hoặc để pha lỗng thành các các dung dịch cĩ nồng độ khác nhau tùy theo phương pháp thử nghiệm.
3.2.4.1 Xác định hàm lượng polyphenol, flavonoid và alkaloid tổng của các cao chiết
Định tính thành phần hĩa học của các cao chiết
Các cao chiết đã được kiểm tra định tính về sự hiện diện của các thành phần hĩa học như alkaloid, flavonoid, steroid, glycoside, saponin và tanin theo mơ tả của Nguyễn Kim Phi Phụng (2007).
Phương pháp định lượng polyphenol tổng
Tổng hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp so màu Folin- Ciocalteu (Singleton et al., 1999). Phản ứng gồm 250 µL cao chiết; 250 µL nước khử ion và 250 µL thuốc thử Folin-Ciocalteu (25%). Sau 8 phút, 250 µL dung dịch sodium carbonate 10% đã được thêm vào và lắc đều. Sau khi ủ 30 phút ở 40oC, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 765 nm. Hàm lượng polyphenol được xác định tương đương miligam gallic acid trên mỗi gram cao chiết (mg GAE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng flavonoid tổng
Tổng hàm lượng flavonoid được xác định theo quy trình được mơ tả bởi Sultana
et al. (2009) cĩ hiệu chỉnh. Hỗn hợp phản ứng gồm 200 µL cao chiết; 200 µL nước khử ion và 200 µL NaNO2 5% được ủ trong 5 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được thêm vào 40 µL AlCl3 (10%) và ủ trong 6 phút. Tiếp theo, thêm 400 µL NaOH 1M. Thể tích cuối cùng được điều chỉnh thành 1000 µL bằng nước khử ion và trộn kỹ. Sau 15 phút, hỗn hợp phản ứng được đo độ hấp thụ quang phổ ở bước sĩng 510 nm. Hàm lượng flavonoid được xác định tương đương miligam quercetin trên mỗi gram cao chiết (mg QE/g cao chiết).
Phương pháp định lượng alkaloid tổng
Hàm lượng alkaloid được xác định bằng phương pháp hình thành phức hợp với bromocresol green (BCG), tạo thành sản phẩm cĩ màu vàng (Shamsa et al., 2008). Cao chiết (1 mL) cho phản ứng với 1 mL dung dịch HCl 2N. Sau khi phản ứng 5 phút thì dung dịch trên được lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn. Cho dung dịch trên vào bình tách chiết lần lượt thêm vào 5 mL BCG và 5 mL dung dịch đệm phosphate (pH 4,7). Cuối cùng, hỗn hợp được lắc mạnh bằng bình tách chiết với 10 mL dung dịch chloroform, sau 2 phút phản ứng ở nhiệt độ phịng, tiến hành đo độ hấp thụ quang phổ bước sĩng 470 nm. Hàm lượng alkaloid (mg AE/g cao chiết) trong các dịch ngoại bào được xác định dựa vào phương trình đường chuẩn atropine.
3.2.4.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hĩa in vitro của các cao chiết
Khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do DPPH
Các cao chiết được khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa theo cơ chế trung hịa gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH). Thử nghiệm DPPH được thực hiện theo phương pháp của Shekhar and Anju (2014) cĩ hiệu chỉnh như sau: Cao chiết được pha lỗng ở các nồng độ khác nhau (10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL) gồm 200 µL được phản ứng với 200 µL DPPH (6×10-4 M). Hỗn hợp phản ứng được ủ trong tối, ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 60 phút. Sau đĩ, hỗn hợp được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 517 nm. Vitamin C được sử dụng làm đối chứng dương và khảo sát hiệu quả trung hịa gốc tự do DPPH ở các nồng độ 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36 và 40
µg/mL. Thử nghiệm khảo sát hoạt tính trung hịa gốc tự do DPPH được thực hiện lặp lại 3 lần/ nồng độ và lấy giá trị trung bình. Hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH của cao chiết và vitamin C được xác định dựa vào cơng thức:
Trong đĩ: Ac (A control) là giá trị độ hấp thu quang phổ của mẫu đối chứng âm (methanol); As (A sample) là giá trị độ hấp thu quang phổ của dung dịch mẫu thử
Ngồi ra, hiệu quả kháng oxy hĩa của các cao chiết và vitamin C cịn được xác định dựa vào nồng độ mà tại đĩ cao chiết hay vitamin C trung hịa được 50% lượng gốc tự do DPPH (Effective concentration of 50%, EC50). Giá trị EC50 được tính dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính của hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH.
Khảo sát khả năng khử của các cao chiết
Dung dịch cao chiết được pha lỗng thành các nồng độ: 100, 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/mL. Đồng thời, butylated hydroxyanisole (BHA) cũng được pha theo dãy nồng độ sau: 0, 10, 20, 40, 60, 80 và 100 µg/mL để làm đối chứng dương.
Khả năng khử của các cao chiết và BHA được thực hiện theo phương pháp của Oyaizu (1986) cĩ hiệu chỉnh như sau: 0,5 mL dung dịch cao chiết hoặc BHA theo các nồng độ đã pha và 0,5 mL đệm phosphate (0,2 M, pH=6,6) tiếp tục thêm vào 0,5 mL K3Fe(CN)6 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50oC trong 20 phút. Sau đĩ, hổn hợp được thêm tiếp 0,5 mL CCl3COOH 10% rồi ly tâm 3000 vịng/ phút trong 10 phút. Dịch ly tâm được rút 0,5 mL, thêm vào 0,5 mL nước và 0,1 mL FeCl3 0,1%, lắc đều. Tiến hành đo độ hấp thu quang phổ của hỗn hợp phản ứng ở bước sĩng 700 nm. Khả năng khử của các cao chiết được xác định dựa vào hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương BHA và nồng độ cao chiết khử được 50% gốc tự do (EC50).
Khảo sát hiệu quả kháng oxy hĩa tổng
Khả năng kháng oxy hố tổng (Total antioxidant capacity-TAC) của các cao chiết được đánh giá bằng phương pháp phosphomolybdenum của Prieto et al. (1999). Phương pháp này dùng đánh giá cả chất kháng oxy hĩa hịa tan trong nước và chất kháng oxy hĩa hịa tan trong dầu (Aliyu et al., 2013). Hỗn hợp phản ứng gồm 0,3 mL cao chiết kết hợp với 3 mL dung dịch thử (0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodium phosphate và 4 mM ammonium molybdate). Hổn hợp phản ứng được ủ ở 95oC trong 90 phút. Sau khi ủ, hỗn hợp phản ứng được làm mát ở nhiệt độ phịng và tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sĩng 695 nm. Methanol (0,3 mL) thay cho cao chiết được sử dụng làm đối chứng âm. Khả năng kháng oxy hố tổng của các cao chiết thể hiện bằng hàm lượng chất kháng oxy hĩa tương đương µg/mL trolox và EC50.
3.2.4.3 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của các cao chiết
Các cao chiết cĩ hoạt tính kháng oxy hĩa sẽ được khảo sát hoạt tính kháng viêm
in vitro. Khả năng kháng viêm của cao chiết được khảo sát thơng qua hoạt động ức chế sự biến tính protein được thực hiện theo phương pháp của Shah et al. (2017) cĩ hiệu chỉnh. Dung dịch thử 1 mL (ở các nồng độ khác nhau) được trộn với 1 ml dung dịch BSA 5%. Sau đĩ, hỗn hợp được ủ ở 27oC trong 15 phút. Sự biến tính protein được tạo ra bằng cách giữ hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong 10 phút. Sau khi làm mát, tiến hành đo mật độ quang tại bước sĩng 660 nm. Thuốc kháng viêm diclofenac được sử dụng như chất đối chứng dương. Khả năng ức chế sự biến tính protein của các cao chiết được xác định theo cơng thức sau: % Ức chế = 100 (1-Vt/Vc). Trong đĩ, Vt: giá trị mật độ quang của mẫu thử, Vc: giá trị mật độ quang của mẫu đối chứng khơng cĩ cao chiết.