1.2.1. Nguồn gốc, phân loại virus PRRS
Virus PRRS là một RNA chuỗi đơn dương, được xếp vào bộ Nidovirales, họ
Arteriviridae, chi Arterivirus (Collins et al., 1992). Các thành viên khác trong họ
Arteriviridae còn có virus viêm động mạch ngựa (EAV), virus nâng mức khử hidro lactate (LDV) của chuột lang và virus sốt xuất huyết khỉ (SHFV). Dựa vào sự tương đồng về mặt định hướng hệ gen và cơ chế nhân lên, họ Arteriviridae cùng với các họ
Coronaviridae, Roniviridae và Mesoniviridae được xếp vào bộ Nidovirales (Dea et al.,
1992), trong hệ thống phân loại ICTV (International committee on taxonomy of viruses) (Christianson et al., 1992).
Hình 1.2. Cây phả hệ của virus PRRS
(Nguồn: Amonsin et al., 2009)
Khi phân tích cấu trúc và nguồn gốc hệ gen các nhà khoa học đã chia virus làm 2 nhóm:
Nhóm 1 gồm những virus thuộc chủng Châu Âu (thường gọi là Lelystad Virus-LV).
Nhóm 2 gồm những virus thuộc chủng Bắc Mỹ mà đại diện là VR-2332 (Collins, 1991; Murtaugh et al., 1995).
Hai nhóm virus này có sự tương đồng đến 60% về cấu trúc các ribonucleotide (Han et al., 2006). Sự khác biệt về 40% cấu trúc gen dẫn đến tính đa dạng về di truyền và kháng nguyên. Các nhà khoa học còn cho biết virus PRRS phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau đều có dấu hiệu khác biệt về tính di truyền. Hơn nữa virus của cùng một nhóm cũng có sự khác nhau đến 20% về trình tự và số lượng nucleotide, điển hình là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Tian et al., 2007; Charerntantanakul,
2012), sự đa dạng và khả năng biến đổi cấu trúc di truyền của virus PRRS đó tạo ra sự phức tạp của mầm bệnh lưu hành trên thế giới và gây nhiều khó khăn cho việc tạo vaccine chung phòng bệnh.
Bảng 1.2. So sánh đặc điểm hệ gen của các chủng virus PRRS trên thế giới
Hệ gen 5’ UTR Phần mã hóa ORF 1a ORF 1b ORF 2 ORF 3 ORF 4 ORF 5 ORF 6 ORF 7 3’ UTR Lelysta (M96262) (Hà Lan) 15.111 221 14.763 7.191 4.392 750 798 552 606 522 387 127 VR2332 (AY150564) (Mỹ) 15.451 190 15.071 7.512 4.374 771 765 537 603 525 372 190 GD*(EU109503) (Trung Quốc) 15.353 189 14.981 7.422 4.383 771 765 537 603 525 372 183 (Nguồn: Nielsenet et al.,1999)
(Ghi chú: Độ dài gen và hệ gen tính bằng bp (base pair), đầu 5’ và đầu 3’ là phần không mã hóa ở đầu và cuối hệ gen)
Tổng độ dài của hệ gen của chủng virus VR2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc genotype II, đại diện dòng Bắc Mỹ là 15.451 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 15.071 bp (Nielsen et al., 1999). Hệ gen của virus PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm virus PRRS mới phân lập có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc genotype II, dòng Bắc Mỹ, có độ dài là 15.353 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 14.981 bp (Tian et al., 2007).
Độ dài các gen và trình tự xắp xếp các nucleotide trên gen khác nhau giữa các chủng virus PRRS đã tạo ra khoảng cách về di truyền và sự sai khác về mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng virus PRRS. Đây cũng chính là tính phức tạp về mặt bệnh nguyên của PRRS.
1.2.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen virus PRRS
Cấu trúc virus PRRS quan sát dưới kính hiển vi điển tử có dạng hình cầu, có vỏ bọc, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra, kích thước 45-80 nm và chứa nhân nucleocapside kích thước 25-35nm.
Hệ gen của virus PRRS là một chuỗi RNA đơn dương, dài khoảng 15 kb và chứa 9 khung đọc mở (ORF). ORF1a và ORF1b chiếm khoảng 80% hệ gen virus và được dịch thành hai polyprotein lớn là protein sao chép pp1a và pp1b. Những protein này sau khi dịch mã bởi 4 protease thành 14 protein phi cấu trúc (NSPs), NSP1α, NSP1β và NSP2 đến NSP12. NSP9 mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA và NSP10 mã hóa cho helicase, là hai protein phi cấu trúc chính chịu trách nhiệm sao chép và phiên mã của hệ gen virus. Người ta đã chứng minh được rằng có một vùng đặc biệt thuộc protein NSP11 đóng vai trò quan trọng trọng chu trình sao chép của tất cả các virus thuộc chi Arterivirus (Bautista et al., 2002; Fang and Snijder, 2010). ORFs 2a, 2b và ORF3-7 nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus, sau dịch mã được phân cắt thành các protein cấu trúc của virus PRRS (Dea et al., 1996;
Meulenberg et al., 1995; Wu et al., 2001). Các protein cấu trúc được biểu hiện ra từ các đoạn mRNA nằm ở đầu 3’ của hệ gen virus và có cùng trình tự điều khiển nằm ở đầu 5’ của các đoạn này (Snijder and Meulenberg, 1998). Glycoprotein 5 (GP5), protein màng (M) và nucleoprotein (N) được mã hóa bởi các ORFs 5-7, là các thành phần chính của hạt virus (Dea et al., 2000).
ORF 2a, 3 và 4 mã hóa cho các protein khác thuộc hạt virus bao gồm GP2a, GP3 và GP4. Các protein này tương tác với nhau và tụ hội thành virion như một phức hệ đa thành phần và cũng tham gia vào quá trình nhiễm trùng của virus (Wissink et al., 2005). ORF 2b mã hóa cho protein vỏ (E).
ORF2a, ORF2b và ORFs 3-7 mã hóa lần lượt cho protein cấu trúc virus GP2a, GP2b (E), GP3, GP4, GP5, M và N (Snijder and Meulenberg, 1998); GP2b là một ORF nhỏ ở bên trong, nằm hoàn toàn trong ORF2. GP2a, GP3, và GP4 là các protein vỏ phụ bị glycosyl hóa ở đầu N, tạo thành dị tam hợp bằng liên kết disulphide (Wieringa et al, 2003a; Wissink et al, 2004).
Hình 1.3. Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS
Bảng 1.3. Hệ gen của virus PRRS và các thông tin liên quan Số
TT ORF
Protein được
mã hóa Chức năng
Vai trò trong miễn dịch, bảo hộ 1 ORF1a Prot ei n in kh ông c ấu t rúc
nsp 1 Cystein protease, giống papain IFN và TNF, chất đối kháng mạnh (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nsp 1 Cystein protease, giống papain
nsp 2 Cystein protease, giống papain Chất đối kháng IFN mạnh nsp 3 Protein chuyển màng Chưa có số liệu - chưa biết nsp 4 Serine protease Chưa biết
nsp 5 Protein chuyển màng Chưa biết nsp 6 Chưa biết Chưa biết
nsp 7 Chưa biết Kháng nguyên cho xác định huyết thanh học về sự cảm nhiễm virus
nsp 7 Chưa biết
nsp 8 Chưa biết Chưa biết
2 ORF1b
nsp 9 Polymerase RNA phụ thuộc Chưa biết nsp 10 Helicase Chưa biết
nsp 11 Endoribonuclease Chất đối kháng IFN mạnh nsp 12 Chưa biết Chưa biết
3 ORF2a Prot ei n cấ u tr ú c
GP2a Protein vỏ nhỏ, tương tác với
CD163 Epitop trung hòa nhỏ 4 ORF2b GP2b Protein vỏ nhỏ Chưa biết
5 ORF3 GP3 Protein vỏ nhỏ Epitop trung hòa nhỏ
6 ORF4 GP4 Protein vỏ nhỏ, tương tác với
CD163 Epitop trung hòa nhỏ
8 ORF5 GP5 Protein vỏ chính, tương tác với
sialoadhesin Epitop trung hòa chính
8 ORF6 M protein Protein vỏ chính, tương tác với heparansulfate
Epitop tế bào T, epitop trung hòa nhỏ
9 ORF7 N protein Nucleocapside Epitop không trung hòa
(Nguồn: Charerntantanakul, 2012)
1.2.3. Đa dạng di truyền hệ gen virus PRRS
Virus PRRS có hai genotype với sự tương đồng về nucleotide là 60%, tuy nhiên các tính chất về sinh học của virus PRRS thuộc hai genotype lại rất giống nhau (Kim et al., 2008). Sự tương đồng về nucleotide giữa các chủng phân lập ở Mỹ và vùng Lelystad của Hà Lan chỉ là 45,7% trong ORF1b, 65%-67% trong ORF2, 61%-64% trong ORF3, 63%-66% trong ORF4, và 61%-63% trong ORF5 (Meng et al., 1995a; Meng et al., 1995b).
chủng phân lập ở Mỹ hoặc giữa các chủng phân lập ở Châu Âu, tuy nhiên có sự bến đổi di truyền khá mạnh trong các gen thuộc khung đọc ORF6 và ORF7 giữa các chủng phân lập ở Châu Âu và Mỹ. Sự khác biệt giữa các chủng ở Mỹ chỉ là 2,5%-7,9%, trong khi đó sự khác biệt giữa các chủng ở Mỹ và vùng Lelystad là 35% (Kapur et al., 1996).
Trình tự ORF1 cũng có sự sai khác rất lớn giữa các chủng phân lập ở Châu Âu và Mỹ, sự tương đồng chỉ đạt 55% (Allende et al., 1999; Nelsen et al., 1999).
ORF1b có tính bảo thủ cao hơn ORF1a và độ tương đồng về nucleotide đạt 63,4%. Sự biến đổi nhiều nhất được tìm thấy trong vùng NSP2 của hệ gen virus. Độ tương đồng về axit amin chỉ đạt 47% giữa các mẫu phân lập ở Châu Âu và Mỹ. Sự đa hình gen lớn nhất được tìm thấy trong vùng NSP2 của virus LV. Khái niệm về nhóm virus có liên quan với nhau được hình thành bởi một hoặc nhiều đột biến giống nhau (quasispecies) khi virus đồng nhiễm ở động vật đã được Goldberg và công sự (2003) đề xuất khi phân tích trình tự các chủng virus PRRS khác nhau nhiễm trùng lây lan giữa các loài. Đã có các bằng chứng về sự xuất hiện các quần thể phụ của virus PRRS biến đổi về mặt di truyền các chủng phân lập từ cơ quan sinh sản của lợn sau khi có tiến hóa kiểu quasispecies (quasispecies evolution) (Rowland et al., 1999). Điều quan trọng là việc xuất hiện các quần thể phụ của virus PRRS biến đổi về mặt di truyền sẽ gây khó khăn cho việc tiêm chủng phòng PRRS do vaccine sẽ không còn hiệu lực hoặc giảm hiệu lực chống lại các chủng virus PRRS biến đổi di truyền (Domingo et
al., 1998; Duarte et al., 1994; Domingo and Holland, 1992).
1.2.4. Các protein kháng nguyên quan trọng của virus PRRS
Hiểu biết về vai trò của protein trong sự sao chép của virus và sự gây bệnh còn chưa đầy đủ. Vai trò của protein N, M, GP5 rất quan trọng với sự hình thành các hạt virus, nhưng các protein phụ cũng cần thiết cho sự lây nhiễm của virus (Wissink et al., 2004).
Các phân tử glycoprotein nhỏ GP2, GP3, GP4 và protein E tương tác với nhau để tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức hợp trong các tế bào bị nhiễm. Việc hình thành phức hợp này là cần thiết trong việc truyền nhiễm của virion (Das, 2011). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
các ORFs 5-7, là các thành phần chính của hạt virus (Dea et al., 2000). Protein N tương tác với hệ gen virus để hình thành nucleocapsid. M6 tương tác với GP5 để hình thành heterodimer cần thiết cho việc lắp ráp hạt virus. Hạt virus sẽ không giải phóng ra nếu thiếu protein M hoặc GP5 (Mardassi et al.,1996; Wissink et al., 2005).
Protein M (membrane protein) có khối lượng phân tử khoảng 18-19 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ đạt đến 78%-81% (Mardassi, 1995). Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với GP5 cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành hạt virus (Meulenberg, 1997). Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích.
Protein N là một protein nhỏ, có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên và tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20%- 40% lượng protein của phân tử virus (Snijder et al., 1998).
Glycoprotein GP5 là vỏ bọc kết hợp glycogen, đây là protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉ khoảng 50-55% (Mardassi et al., 1995; Meng et al., 1995b). Kháng nguyên GP5 kích thích tạo đáp ứng kháng thể trung hòa chính vì thế do áp lực chọn lọc bởi kháng thể tồn lưu, kháng nguyên bắt buộc phải thay đổi để virus có thể thoát khỏi sự trung hòa của kháng thể tồn lưu. Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5 để trung hòa virus. Những epitope trung hòa này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá. Có ba vị trí epitope kích thích tế bào lympho B đã được xác định, một epitope trung hòa chính nằm ở giữa của ectodomain GP5 (aa 36-52), một epitope không trung hòa (epitope A) và một epitope trung hòa (epitope B) trong ectodomain của protein GP5 (Ostrowski, 2002).
Hình 1.4. Cấu trúc Protein của virus PRRS
(Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-Virus PRRS-structure.asp)
1.2.5. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm
Sau khi bị nhiễm virus PRRS, lợn có đáp ứng miễn dịch ngay, tuy nhiên sự sản sinh kháng thể có những đặc điểm khác thường ở cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. Sự xuất hiện kháng thể này sớm hay muộn có biến động khác nhau ở từng cá thể lợn và cả theo tuổi lợn cũng như sự tồn tại kháng thể này kéo dài cũng rất khác nhau.
Bảng 1.4. Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS qua các phương pháp xét nghiệm
Phương pháp xét nghiệm
Ngày phát hiện được sau nhiễm virus
Tuần đạt đỉnh cao sau nhiễm virus
Ngày cuối phát hiện được sau nhiễm virus
IFA 7-11 ngày 4-5 tuần 158 ngày IPMA 5-9 ngày 5-6 tuần 324 ngày ELISA 9-13 ngày 4-6 tuần 137 ngày SVN 28-35 ngày 10-11 tuần 356 ngày
(Nguồn: Yoon et al., 1995)
Nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch dịch thể ở lợn kháng lại virus PRRS đã cho thấy lợn xuất hiện kháng thể trực tiếp kháng lại protein N sớm nhất, tiếp theo là kháng thể kháng protein M rồi đến kháng thể kháng glycoprotein GP5. Hầu hết các test chẩn đoán phát hiện các kháng thể kháng lại các protein N của virus khoảng sau 1 tuần nhiễm bệnh và tồn tại nhiều tháng nhưng hầu như không có tác động đến sự bảo vệ cho lợn khỏi bị bệnh. Các kháng thể đặc hiệu sinh ra ở giai đoạn đầu này không trung hòa được virus PRRS in vitro cũng như khi thí nghiệm in vivo dùng
kháng thể này tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động, lợn vẫn không được bảo hộ khi công cường độc (Lopez et al., 2004).
Sự xuất hiện sớm các kháng thể đặc hiệu không trung hòa, có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển PRRS. Các kháng thể không trung hòa này vô tình tạo điều kiện cho virus PRRS tăng cường sinh sản trong đại thực bào. Hiện tượng này miễn dịch học gọi là "Sự tăng cường bệnh phụ thuộc vào kháng thể" (ADE: Antibody- Dependent Enhancement), nên đáp ứng kháng thể này lại trở thành có hại cho vật chủ. Đáp ứng dịch thể không trung hòa của virus PRRS đã che bọc cho virus và thúc đẩy sự tiếp thu phân tử virus vào trong đại thực bào (Mateu et al., 2008). Đó là một chiến lược virus dùng để xâm nhập gây bệnh. Vì vậy các test chẩn đoán phát hiện kháng thể đặc hiệu trong máu không liên quan đến kháng thể bảo vệ, nó không phải là kháng thể trung hòa virus.
Hình 1.5. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS
(Nguồn: Lopez et al., 2004)
Sự tương quan khác thường của virus PRRS với các phản ứng miễn dịch của lợn theo thời gian. Ở giai đoạn nhiễm đầu, khi có virus huyết lợn sản sinh kháng thể đặc hiệu không trung hòa, virus và các kháng thể này song song tồn tại cho đến 4 tuần sau nhiễm các tế bào sản sinh IFN- và kháng thể trung hòa virus mới phát triển. Những kháng thể trung hòa này chủ yếu chống lại protein GP5 nơi bao gồm chủ yếu các epitope trung hòa (Lei et al., 2014). Đáp ứng miễn dịch chống GP5 yếu và chậm là do mức N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa, một hiện tượng gọi là rào chắn N-glycan. Hơn nữa epitope tại vị trí axit amin 27-30 trên GP5 của virus
PRRS type 2 không bị tác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, dẫn đến việc làm chậm sản sinh kháng thể trung hòa chống virus PRRS. Sự xuất hiện sớm các kháng thể không phải trung hòa có vai trò lớn trong sự tiến triển của hội chứng. Cụ thể nó thúc đẩy sự nhân lên của virus trong đại thực bào ở phế nang thông qua các yếu tố bám dính (Duan et al., 1998) giữa virus
PRRS và đại thực bào hay còn được gọi là sự tăng cường yếu tố phụ thuộc kháng thể (Yoon et al., 1997). Người ta nhận thấy đáp ứng miễn dịch của lợn đối với PRRS có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của dịch tả lợn. Ở những lợn mắc PRRS, virus sẽ làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch đối với việc tiêm phòng vaccine dịch tả lợn (Lý Thị Liên Khai và cs., 2012).
1.2.6. Sức đề kháng của virus PRRS
Virus PRRS có vỏ bọc ngoài, sự sống sót của virus bên ngoài vật chủ chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng. Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus. Ánh sáng mặt trời và