Hiểu biết về vai trò của protein trong sự sao chép của virus và sự gây bệnh còn chưa đầy đủ. Vai trò của protein N, M, GP5 rất quan trọng với sự hình thành các hạt virus, nhưng các protein phụ cũng cần thiết cho sự lây nhiễm của virus (Wissink et al., 2004).
Các phân tử glycoprotein nhỏ GP2, GP3, GP4 và protein E tương tác với nhau để tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức hợp trong các tế bào bị nhiễm. Việc hình thành phức hợp này là cần thiết trong việc truyền nhiễm của virion (Das, 2011).
các ORFs 5-7, là các thành phần chính của hạt virus (Dea et al., 2000). Protein N tương tác với hệ gen virus để hình thành nucleocapsid. M6 tương tác với GP5 để hình thành heterodimer cần thiết cho việc lắp ráp hạt virus. Hạt virus sẽ không giải phóng ra nếu thiếu protein M hoặc GP5 (Mardassi et al.,1996; Wissink et al., 2005).
Protein M (membrane protein) có khối lượng phân tử khoảng 18-19 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ đạt đến 78%-81% (Mardassi, 1995). Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với GP5 cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành hạt virus (Meulenberg, 1997). Mặc dù chức năng của nó được biết rất ít nhưng nó được xem như có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích.
Protein N là một protein nhỏ, có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên và tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tương tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20%- 40% lượng protein của phân tử virus (Snijder et al., 1998).
Glycoprotein GP5 là vỏ bọc kết hợp glycogen, đây là protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương đồng axit amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉ khoảng 50-55% (Mardassi et al., 1995; Meng et al., 1995b). Kháng nguyên GP5 kích thích tạo đáp ứng kháng thể trung hòa chính vì thế do áp lực chọn lọc bởi kháng thể tồn lưu, kháng nguyên bắt buộc phải thay đổi để virus có thể thoát khỏi sự trung hòa của kháng thể tồn lưu. Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5 để trung hòa virus. Những epitope trung hòa này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá. Có ba vị trí epitope kích thích tế bào lympho B đã được xác định, một epitope trung hòa chính nằm ở giữa của ectodomain GP5 (aa 36-52), một epitope không trung hòa (epitope A) và một epitope trung hòa (epitope B) trong ectodomain của protein GP5 (Ostrowski, 2002).
Hình 1.4. Cấu trúc Protein của virus PRRS
(Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-Virus PRRS-structure.asp)
1.2.5. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi virus PRRS xâm nhiễm
Sau khi bị nhiễm virus PRRS, lợn có đáp ứng miễn dịch ngay, tuy nhiên sự sản sinh kháng thể có những đặc điểm khác thường ở cả miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào. Sự xuất hiện kháng thể này sớm hay muộn có biến động khác nhau ở từng cá thể lợn và cả theo tuổi lợn cũng như sự tồn tại kháng thể này kéo dài cũng rất khác nhau.
Bảng 1.4. Phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS qua các phương pháp xét nghiệm
Phương pháp xét nghiệm
Ngày phát hiện được sau nhiễm virus
Tuần đạt đỉnh cao sau nhiễm virus
Ngày cuối phát hiện được sau nhiễm virus
IFA 7-11 ngày 4-5 tuần 158 ngày IPMA 5-9 ngày 5-6 tuần 324 ngày ELISA 9-13 ngày 4-6 tuần 137 ngày SVN 28-35 ngày 10-11 tuần 356 ngày
(Nguồn: Yoon et al., 1995)
Nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch dịch thể ở lợn kháng lại virus PRRS đã cho thấy lợn xuất hiện kháng thể trực tiếp kháng lại protein N sớm nhất, tiếp theo là kháng thể kháng protein M rồi đến kháng thể kháng glycoprotein GP5. Hầu hết các test chẩn đoán phát hiện các kháng thể kháng lại các protein N của virus khoảng sau 1 tuần nhiễm bệnh và tồn tại nhiều tháng nhưng hầu như không có tác động đến sự bảo vệ cho lợn khỏi bị bệnh. Các kháng thể đặc hiệu sinh ra ở giai đoạn đầu này không trung hòa được virus PRRS in vitro cũng như khi thí nghiệm in vivo dùng
kháng thể này tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động, lợn vẫn không được bảo hộ khi công cường độc (Lopez et al., 2004).
Sự xuất hiện sớm các kháng thể đặc hiệu không trung hòa, có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển PRRS. Các kháng thể không trung hòa này vô tình tạo điều kiện cho virus PRRS tăng cường sinh sản trong đại thực bào. Hiện tượng này miễn dịch học gọi là "Sự tăng cường bệnh phụ thuộc vào kháng thể" (ADE: Antibody- Dependent Enhancement), nên đáp ứng kháng thể này lại trở thành có hại cho vật chủ. Đáp ứng dịch thể không trung hòa của virus PRRS đã che bọc cho virus và thúc đẩy sự tiếp thu phân tử virus vào trong đại thực bào (Mateu et al., 2008). Đó là một chiến lược virus dùng để xâm nhập gây bệnh. Vì vậy các test chẩn đoán phát hiện kháng thể đặc hiệu trong máu không liên quan đến kháng thể bảo vệ, nó không phải là kháng thể trung hòa virus.
Hình 1.5. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS
(Nguồn: Lopez et al., 2004)
Sự tương quan khác thường của virus PRRS với các phản ứng miễn dịch của lợn theo thời gian. Ở giai đoạn nhiễm đầu, khi có virus huyết lợn sản sinh kháng thể đặc hiệu không trung hòa, virus và các kháng thể này song song tồn tại cho đến 4 tuần sau nhiễm các tế bào sản sinh IFN- và kháng thể trung hòa virus mới phát triển. Những kháng thể trung hòa này chủ yếu chống lại protein GP5 nơi bao gồm chủ yếu các epitope trung hòa (Lei et al., 2014). Đáp ứng miễn dịch chống GP5 yếu và chậm là do mức N-glycosyl hóa bao quanh epitope trung hòa, một hiện tượng gọi là rào chắn N-glycan. Hơn nữa epitope tại vị trí axit amin 27-30 trên GP5 của virus
PRRS type 2 không bị tác động trung hòa mà ngược lại, có chức năng làm giảm đáp ứng miễn dịch dịch thể, dẫn đến việc làm chậm sản sinh kháng thể trung hòa chống virus PRRS. Sự xuất hiện sớm các kháng thể không phải trung hòa có vai trò lớn trong sự tiến triển của hội chứng. Cụ thể nó thúc đẩy sự nhân lên của virus trong đại thực bào ở phế nang thông qua các yếu tố bám dính (Duan et al., 1998) giữa virus
PRRS và đại thực bào hay còn được gọi là sự tăng cường yếu tố phụ thuộc kháng thể (Yoon et al., 1997). Người ta nhận thấy đáp ứng miễn dịch của lợn đối với PRRS có ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của dịch tả lợn. Ở những lợn mắc PRRS, virus sẽ làm giảm khả năng đáp ứng miễn dịch đối với việc tiêm phòng vaccine dịch tả lợn (Lý Thị Liên Khai và cs., 2012).
1.2.6. Sức đề kháng của virus PRRS
Virus PRRS có vỏ bọc ngoài, sự sống sót của virus bên ngoài vật chủ chịu tác động của nhiệt độ, pH và sự tiếp xúc với các chất sát trùng. Các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit dễ dàng tiêu diệt virus. Ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng.
Virus PRRS có khả năng sống sót trong khoảng thời gian dài hơn 4 tháng ở nhiệt độ dao động trong khoảng -70oC đến -20oC, 20 phút ở 56oC, 24 giờ ở 30oC và 6 ngày ở 21oC. Tuy nhiên khả năng sống của virus PRRS giảm nhanh khi nhiệt độ tăng lên.
Virus PRRS bền vững ở trong khoảng từ pH 6,5-7,5, tuy nhiên tính gây nhiễm giảm ở pH < 6,0 hoặc pH > 7,65 (Paton et al., 1991).
Ngoài ra virus cũng bị vô hoạt bởi các điều kiện bất lợi của môi trường ngoài như ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại.
1.2.7. Đặc điểm nuôi cấy virus PRRS
Có nhiều dòng tế bào có thể sử dụng để nuôi cấy virus như: Đại thực bào phế nang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM), dòng tế bào CL 2621, tế bào MA 104, tế bào Marc 145.
PAM là môi trường tốt nhất cho phân lập virus vì nó có độ nhạy cao nhất, virus có thể nhân lên với số lượng lớn và có thể nuôi cấy tất cả các chủng virus PRRS lưu hành trên thế giới. Nhược điểm của PAM là phải chuẩn bị môi trường từ những con lợn khỏe mạnh và PAM không phải là tế bào dòng nên sự nhân lên của tế bào là có giới hạn do đó không thể lưu giữ virus trong thời gian lâu dài (Kim et al., 1993).
Với các dòng tế bào như: MA-104, Marc 145, CL-2621 hiện đang được sử dụng nhiều hơn và khắc phục được nhược điểm của tế bào PAM. Trong đó Marc 145 có thể phân lập được 11 dòng virus của cả 2 chủng Châu Âu và Bắc Mỹ, hơn nữa thời gian và mức độ gây bệnh tích tế bào, số lượng virus thu được sau khi phân lập đều đảm bảo yêu cầu nên dòng tế bào này đang được ứng dụng nhiều cho chẩn đoán và nghiên cứu.
Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang dùng loại tế bào Marc 145 để phân lập virus PRRS, sau 12, 24, 36, 72 giờ nuôi cấy, quan sát các CPE (Cytopathic effect hay cytopathogenic effect) để đánh giá sự nhân lên của virus, đã có công bố về những nghiên cứu tác động của virus PRRS lên tế bào Marc 145.
Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đường nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor. Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus và trên Marc 145 là vimentin. Vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau.
Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh.
Quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145, hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48-72 giờ nuôi cấy. Hiệu giá virus đạt đỉnh cao lúc 24-48 giờ và có thể duy trì tới 60-70 giờ sau nuôi cấy (Kim et al., 1993).
1.3. Nghiên cứu tạo vaccine PRRS
1.3.1. Khái niệm
Vaccine là chế phẩm sinh học có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu, chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh cụ thể.
Tác dụng của phòng bệnh bằng vaccine là sau tiêm phòng lợn vẫn khỏe mạnh, phát triển bình thường. Trong một số trường hợp, sau khi tiêm phòng vẫn bị nhiễm virus PRRS thì biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể đều nhẹ hơn, thời gian bài thải virus cũng ngắn hơn rất nhiều so với lợn không được tiêm vaccine (Tô Long Thành và cs., 2014).
Vaccine là một trong những công cụ can thiệp phòng và dập dịch bệnh hữu hiệu nhất, việc giám sát virus PRRS trên cơ sở thông tin di truyền, đặc điểm cấu
trúc kháng nguyên, nguồn gốc chủng giữa chủng làm vaccine và chủng virus đang lưu hành là yếu tố quyết định đảm bảo sự thành công của giải pháp can thiệp bằng vaccine (Đỗ Hữu Dũng, 2015).
1.3.2. Các loại vaccine được nghiên cứu phòng PRRS
Từ khi hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được xác định, vaccine đầu tiên được nghiên cứu và đưa vào sử dụng rộng rãi ở châu Âu từ 1993 và châu Mỹ năm 1995. Đến nay, rất nhiều các nghiên cứu phát triển vaccine PRRS, hàng loạt thế hệ vaccine PRRS ra đời và thương mại hóa rộng rãi. Tuy nhiên, tùy theo chiến lược của mỗi quốc gia, trình độ phát triển công nghệ và điều kiện cụ thể để quyết định dạng vaccine PRRS thiết kế và sử dụng loại vaccine phù hợp với tình hình thực tế. Hiện tại các loại vaccine PRRS theo công nghệ đã được sản xuất và sử dụng gồm 3 nhóm chính:
- Vaccine vô hoạt gồm vaccine vô hoạt kinh điển và vaccine vô hoạt biến đổi gen. Vaccine PRRS vô hoạt được sản xuất bằng cách nuôi cấy tác nhân virus PRRS, sau đó bất hoạt virus bằng nhiệt hoặc hóa chất hoặc chỉ tách lấy một phần cần thiết từ tác nhân virus PRRS.
Đặc tính an toàn của vaccine PRRS vô hoạt: Vaccine vô hoạt không gây ra phản ứng không mong muốn hoặc ảnh hưởng bất lợi đối với sức khỏe của đàn lợn được tiêm phòng. Vaccine vô hoạt PRRS được xem là có đặc tính an toàn cao.
Đặc tính sinh miễn dịch của vaccine PRRS vô hoạt: Nhược điểm của vaccine PRRS vô hoạt là chỉ tạo mức kháng thể dịch thể không cao đặc biệt là kháng thể trung hòa rất kém và dường như không có. Tuy nhiên, vaccine PRRS vô hoạt có tác dụng kích thích cơ thể lợn tăng cường sản sinh kháng thể đồng thời tăng miễn dịch tế bào kháng virus, ở đàn lợn đã nhiễm virus PRRS chúng làm tăng sinh tế bào lympho và thải tiết chất kháng virus Interferon gamma. Tác dụng này có thể lượng hóa được từ sau 2 tuần tiêm vaccine (Bassaganya-Riera et al., 2004; Piras et al.,
2005; Kim et al., 2011). Trong một số trường hợp, vaccine vô hoạt hoàn toàn không có hiệu lực hoặc hiệu lực rất thấp, vaccine vô hoạt không giảm được virus huyết.
Vaccine vô hoạt có khả năng tạo kháng thể trung hòa, nhưng không bảo vệ được lợn khỏi sự nhiễm trùng virus PRRS khi công cường độc với chủng độc lực (Zuckermann et al., 2007).
của virus PRRS trong thai. Bằng chứng là từ các dấu hiệu lâm sàng, mất khả năng sinh sản, virus huyết và nhiễm trùng qua đường nhau thai ở đàn lợn con. Vaccine vô hoạt cũng không có khả năng bảo vệ lợn nái và lợn đực giống (Scortti et al., 2007).
Một vài loại vaccine vô hoạt đang được lưu hành, như Progressis® của Merial, Ingelvac®-PRRS KV của Boehringer Ingelheim, hoặc là Suipravac®-PRRS của Hipra.
- Vaccine PRRS thế hệ mới
Các định hướng nghiên cứu vaccine PRRS thế hệ mới trên nguyên lý công nghệ gen hiện đang tập trung vào mục tiêu nâng cao tính sinh miễn dịch, bảo hộ phổ rộng nhằm tạo “vaccine lý tưởng”, theo đó việc sử dụng đa chủng vaccine và bổ trợ nâng cao đáp ứng miễn dịch được ưu tiên. Một loạt các công trình nghiên cứu tạo vaccine thế hệ mới thay thế cho con đường vaccine kinh điển như: vaccine DNA, vaccine tiểu phần, vaccine sinh tổng hợp peptide; các vaccine sử dụng vector mang virus, vi khuẩn và thực vật. Tuy nhiên, trên thực tế hiệu quả phòng PRRS của vaccine thế hệ mới chưa đạt hiệu quả rõ ràng nên chưa sử dụng phổ biến để phòng PRRS.
Bảng 1.5. Một số vaccine thế hệ mới
Loại vaccine ORF/GP
Tính sinh
miễn dịch Khả năng bảo hộ
Kháng thể CMI Chủng tương đồng Chủng không tương đồng
DNA Vaccine ORF1-7 + + + ND
Vaccine dưới đơn vị GP5 Yếu Yếu - ND
Peptide tổng hợp GP5 - - ND -
Vaccine vector Adenovirus GP3,4,5 + ND ND Vaccine vector PRV GP5,M + + + ND Vaccine vector virus đậu GP3,5,M + + + ND Vaccine vector TGEV GP5,M + ND + ND Vaccine vector vi khuẩn GP5,M + - + ND Vaccine nguồn gốc tế bào côn trùng ORF3,5,7 + ND + ND Vaccine sản xuất trên thực vật GP5 + + ND ND
(Nguồn: Wasin Charerntantanakul, 2012)
Chú thích: (+): có; (-): Không; ND: Không xác định; CMI: Miễn dịch qua trung gian tế bào
Một hướng phát triển vaccine phòng bệnh tại cửa vào phổi, âm hộ là vaccine niêm mạc. Đối với virus PRRS, sử dụng vaccine tái tổ hợp mang GP5, protein N gắn với giải độc tố phẩy khuẩn tả là một vaccine niêm mạc. Tuy nhiên, bằng đường tiêm bắp, vaccine này không bảo hộ lợn, gây triệu chứng phổi và không làm giảm virus huyết (Hyland et al., 2004).
Protein tái tổ hợp GP5-ELP của virus PRRS được tổng hợp trong mô lá cây thuốc lá có khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột thí nghiệm gợi mở hướng nghiên cứu phát triển vaccine tiểu đơn vị từ thực vật phòng chống virus PRRS ở Việt Nam (Nguyễn Thị Minh Hằng và cs., 2018).