Khôi phục tế bào: Tế bào Marc 145 được bảo quản ở -196oC trước khi tiến
hành nuôi cấy cần khôi phục lại tế bào. Chuẩn bị môi trường đầy đủ (MEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37oC trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy).
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ 25oC-30oC trong bể ủ cách thủy trong khoảng 2 phút, cho vào tube có 10ml môi trường đầy đủ (MEM, 10% FBS).
Bước 2: Ly tâm loại bỏ nước nổi và giữ lại cặn tế bào, cho môi trường vào đánh tan cặn tế bào.
Bước 3: Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy chứa 5ml môi trường đầy đủ. Bước 4: Đưa vào nuôi cấy và theo dõi sự phát triển của tế bào. Giữ tế bào ở 37oC, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào. Khi tế bào đạt 100% diện tích nuôi cấy có thể chuyển đời sang chai nuôi khác.
Cấy truyền tế bào
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi trong chai 75cm2, rửa tế bào bằng 20ml dung dịch PBS (không chứa Ca2+ hoặc Mg2+), sau đó hút bỏ dung dịch rửa.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng 5ml Trypsin-EDTA. Ủ trong 5 đến 10 phút. Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng. Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào, hòa tan tế bào trong 6ml
môi trường đầy đủ. Đếm tế bào, pha loãng tế bào 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) dùng buồng đếm đếm số tế bào trên kính hiển vi, tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Cấy truyền tế bào, pha loãng tế bào đến 2x105 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, chia huyễn dịch tế bào vào bình nuôi (6ml/bình T25, 15ml/ bình T75).
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37oC, 5%CO2
hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
Thu tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy truyền tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6.
Bước 5: Chia ống tế bào, pha loãng tế bào ở 5x106 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản 1ml/ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20oC trong 2-3 giờ, chuyển sang -80oC khoảng 15 giờ, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng (TCVN 8400-21:2014).