02HY và 05TB
Thực nghiệm gây nhiễm 02 chủng virus PRRS 02HY và 05TB trên lợn để kiểm tra độc lực và các đặc tính sinh học của 2 chủng PRRS thông qua đánh giá khả năng gây bệnh tích điển hình, đặc trưng, các biểu hiện triệu chứng lâm sàng, chỉ số virus huyết, khả năng kích thích sinh kháng thể miễn dịch của lợn, khả năng gây bệnh tích tế bào, khả năng nhân lên, thích ứng của virus PRRS trên môi trường tế bào Marc 145 là các tiêu chí cơ bản để chọn chủng virus cường độc phục vụ mục đích tạo giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS nhược độc.
3.1.1. Biểu hiện triệu chứng lâm sàng ở lợn gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB
Gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY và 05TB qua đường tiêm bắp sau tai trên tổng số 12 lợn, 6 lợn/1 lô, lô đối chứng 03 lợn, toàn bộ lợn thí nghiệm ở lứa tuổi từ 5 tuần tuổi với liều 1ml x 104TCID50/1lợn, theo dõi trong 14 ngày. Kết quả theo dõi biểu hiện lâm sàng của lợn thí nghiệm được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả biểu hiện lâm sàng của lợn gây nhiễm virus PRRS chủng 02HY và 05TB Số Lô Số lợn/1lô Chủng virus Liều gây nhiễm Số lợn
ốm Triệu chứng biểu hiện
1 6 02HY 1ml
104 TCID50
6
Ốm, sốt, bỏ ăn hoặc ăn ít, phát ban, sưng mí mắt, tai xanh, khó thở, ho, táo bón, vận động lờ đờ. Có 2 lợn sốt cao
42oC, co giật, ăn ít trở lại và hồi phục
dần sau 13-14 ngày sau gây nhiễm
2 6 05TB 1ml
104TCID50
6
Ốm, sốt, bỏ ăn hoặc ăn ít, phát ban, sưng mí mắt, tai tím, khó thở, ho, táo bón, rối loạn vận động, ăn ít trở lại và hồi phục dần sau 9-10 ngày sau gây nhiễm
3 3 Đối
chứng 0
Lợn khỏe, phát triển bình thường, không có biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS
+ Lô thí nghiệm số 1:
Triệu chứng lâm sàng chủ yếu xuất hiện trên lợn thí nghiệm:
Ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm lợn ốm, ủ rũ, mệt mỏi và kéo dài 4-5 ngày; sưng mí mắt, mắt có nhử kéo dài đến ngày thứ 14.
Tai xanh nhạt xuất hiện vào ngày thứ 4 sau gây nhiễm ở 3/6 lợn (chiếm 50%) số lợn sau đó hồi phục, hiện tượng tai xanh mất dần.
Hắt hơi và ho vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm, tăng dần ở ngày thứ 9-10 sau đó thuyên giảm.
Lợn kém ăn bắt đầu vào ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm, bỏ ăn 1-3 ngày, ăn ít trở lại sau 10-11 ngày từ sau khi gây nhiễm virus PRRS, sau 13-14 ngày lợn hồi phục dần, không có lợn chết.
Thân nhiệt tăng đến 41-42oC vào ngày ngày thứ 4, sốt cao kéo dài 3-5 ngày, 02 lợn có hiện tượng co giật, kèm theo sốt là ban đỏ, thở khó, thở nhanh, táo bón xuất hiện ngày thứ 6 và kéo dài 4-6 ngày sau đó.
+ Lô thí nghiệm 2:
Theo dõi trong 14 ngày tính từ sau lây nhiễm virus PRRS trên lợn cho thấy: Toàn bộ 6 lợn gây nhiễm đều ốm vào ngày thứ 3-4, bỏ ăn hoặc ăn ít dần, từ sau khi gây nhiễm virus PRRS 9-10 ngày lợn hồi phục dần, không có lợn chết.
Các triệu chứng như: Tai xanh nhạt xuất hiện rồi biến mất, hắt hơi và ho vào ngày thứ 5 sau gây nhiễm, tăng dần ở ngày thứ 7-9 sau đó thuyên giảm.
Lợn kém ăn bắt đầu vào ngày thứ 3-4 sau gây nhiễm, bỏ ăn 1-3 ngày, ăn ít trở lại sau 1 tuần.
Thân nhiệt tăng đến 41-41,5oC vào ngày ngày thứ 4, sốt cao kéo dài 3-5 ngày, da xuất hiện ban đỏ, thở nhanh, thở khó, kèm theo sốt là táo bón xuất hiện và kéo dài 4-6 ngày sau đó.
Như vậy, sau gây nhiễm 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực trên lợn thí nghiệm, ở cả 2 lô lợn 1 và 2 cho thấy các biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS rất điển hình là lợn ốm sốt, bỏ ăn hoặc giảm ăn, phát ban, sưng mí mắt, tai xanh, khó thở, ho, táo bón, vận động lờ đờ, xuất huyết dưới vùng da mỏng. Tuy nhiên khả năng lợn hồi phục dần sau công cường độc của 2 lô khác nhau, lô 1 chậm
hơn lô 2, lô số 1 là 13-14 ngày, lô số 2 là 9-10 ngày từ sau khi gây nhiễm virus PRRS, lô số 1 có 2 lợn sốt cao 42oC và bị co giật. Lô đối chứng số 3, lợn khỏe mạnh, phát triển bình thường, không có biểu hiện lâm sàng của lợn mắc PRRS.
3.1.2. Khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm
Theo dõi khả năng tăng trọng của 3 lô lợn: Lô lợn đối chứng và 2 Lô thí nghiệm sau 14 ngày từ khi gây nhiễm bằng 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực, kết quả được tổng hợp ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả theo dõi khả năng tăng trọng của lợn Liều tiêm 1ml 104 TCID50 Lợn số Khối lượng trước gây nhiễm
virus (kg)
Khối lượng sau gây nhiễm virus
(kg) Tăng trọng từng con (kg) Tăng trọng trung bình (kg) Lô 1 (02HY) 1 8,7 9,0 0,3 0,13 2 9,0 8,8 -0,2 3 9,5 10,2 0,7 4 8,6 8,8 0,2 5 8,5 8,5 0,0 6 9,2 9,0 -0,2 Lô 2 (05TB) 7 8,8 9,5 0,7 0,88 8 8,9 9,8 0,9 9 9,4 10,0 0,6 10 9,5 10,2 0,7 11 9,0 9,8 0,8 12 8,9 10,5 1,6 Lô đối chứng 13 9,1 15,3 6,2 6,6 14 8,5 15,0 6,5 15 9,0 16,0 7,0
Theo dõi khả năng tăng trọng của lợn thí nghiệm ở lô 1 sau 14 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY cường độc, lợn gần như không tăng cân, tăng trọng trung bình của lô thí nghiệm là 0,13 kg/lợn, trong đó có 2 lợn giảm cân. Lợn ở lô thí nghiệm số 2 sau 14 ngày gây nhiễm chủng virus PRRS 05TB tăng trọng trung bình mức nhẹ 0,88 kg/lợn, không có lợn giảm cân. Lô đối chứng
không gây nhiễm chủng độc lực, lợn phát triển bình thường tăng trọng trung bình 6,6 kg/lợn sau 14 ngày.
3.1.3. Kết quả kiểm tra bệnh tích ở lợn thí nghiệm
Sau khi gây nhiễm 21 ngày 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực trên lợn, mổ khám kiểm tra bệnh tích. Lợn của hai lô thí nghiệm đều có các dấu hiệu bệnh tích điển hình ở các khí quan của lợn nhiễm virus PRRS.
+ Bệnh tích đại thể:
Bảng 3.3. Bệnh tích đại thể ở lợn gây nhiễm virus PRRS
STT Bệnh tích Số lợn thí nghiệm Số lợn có biểu hiện Tỉ lệ (%)
1 Phổi xuất huyết 12 12 100,0 2 Viêm màng phổi 12 6 50,0
3 Phổi tụ máu 12 6 50,0
4 Phù phổi 12 2 16,7
5 Tử cung viêm, xuất huyết 12 3 25,0 6 Hạch lympho xuất huyết, sưng to 12 11 92,0 7 Lách sần sùi, tím tái 12 9 75,0 8 Gan thâm sẫm, có mảng đen 12 2 16,7 9 Thận xuất huyết 12 7 58,3 10 Ruột non xuất huyết 12 1 8,3 11 Tim bẹp, cơ nhão, màng viêm dính 12 2 16,7
Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS (Bảng 3.3) cho thấy bệnh tích chủ yếu tập trung ở phổi: Phổi xuất huyết tạo ra các đám, các mảng loang lổ, phổi sẹp, sát vào khung xương sườn, viêm màng phổi, bề mặt cắt của phổi khô, phổi chắc đặc, hạch phổi có bệnh tích.
Bệnh tích tổn thương biểu hiện rõ ở một số cơ quan khác như: Tim bẹp, cơ tim nhão, màng bao tim bị viêm dính, các bộ phận gan, lách, thận có màu thẫm hơn so với bình thường, trên bề mặt có các mảng đen, lách lợn bệnh thường dai chắc, sần sùi và tím tái, thận xuất huyết lấm chấm khi bổ đôi thận thấy các bể thận xuất huyết.
Bệnh tích phổi
(Phổi xuất huyết, xẹp, dính sát khung sườn)
Bệnh tích hạch lympho (Hạch tụ máu thâm tím, sưng to)
Hình 3.1. Hình ảnh bệnh tích đại thể ở phổi và hạch lympho
+ Bệnh tích vi thể:
Mổ khám 12 lợn quan sát các biến đổi đại thể sau đó lấy mẫu bệnh phẩm các cơ quan, bộ phận: phổi, hạch phổi, lách, thận ngâm trong formol 10% và làm tiêu bản để xác định các biến đổi vi thể. Kết quả thu được cho thấy bệnh tích vi thể ở 12 lợn được nghiên cứu phổ biến là những biến đổi ở phổi. Phế nang chứa đầy dịch rỉ viêm và đại thực bào, quan sát thấy xuất hiện tế bào khổng lồ nhiều nhân, đại thực bào phân huỷ trong phế nang.
Trên tiêu bản bệnh phẩm thấy xuất hiện vùng phế quản tổn thương xen kẽ vùng lành. Vách phế quản xung huyết đôi khi bị phù, ngoài ra còn tìm thấy thể vùi trong nguyên sinh chất những tế bào bị virus phá huỷ.
Phổi xuất huyết, lòng phế quản và phế nang chứa đầy hồng cầu màu đỏ tươi. Nhiều tế bào phổi bị hoại tử và có huyết khối nhỏ trong lòng mạch quản do các thành phần máu tách ra và đông lại.
Lách sung huyết, thoái hoá và hoại tử. Trên tiêu bản lách vách đứt nát, các tế bào thoái hoá xen kẽ với các tế bào lành, thâm nhiễm hồng cầu lan tràn trong nhu mô lách.
Thận ngoài những biến đổi bệnh lý như thâm nhiễm tế bào viêm, tế bào thận bị thoái hoá, hoại tử thì có có những biến đổi ở kẽ thận như xuất huyết, tập trung nhiều hồng cầu và các lymphocyte, monocyte.
Viêm phế nang Teo tuỷ trắng ở lách
Hình 3.2. Hình ảnh bệnh tích vi thể
3.1.4. Kiểm tra virus huyết ở lợn thí nghiệm
Thí nghiệm gây nhiễm lợn bằng 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB độc lực, theo dõi sự xuất hiện và thời gian lưu hành của virus PRRS trong máu lợn sau gây nhiễm, kết quả được trình bày ở Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Virus PRRS trong huyết thanh lợn thí nghiệm tại các thời điểm thu huyết thanh STT Ngày lấy huyết thanh kiểm tra virus PRRS
N0 N3 N7 N10 N15 N21 Lô 1 (Chủng 02HY) Lợn 1 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 2 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 3 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 4 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 5 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 6 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lô 2 (Chủng 05TB) Lợn 7 Phân lập - + + + + - rRT-PCR - + + + + - Lợn 8 Phân lập - + + + + - rRT-PCR - + + + + +
STT Ngày lấy huyết thanh kiểm tra virus PRRS N0 N3 N7 N10 N15 N21 Lợn 9 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 10 Phân lập - + + + + - rRT-PCR - + + + + + Lợn 11 Phân lập - + + + + + rRT-PCR - + + + + + Lợn 12 Phân lập - + + + + - rRT-PCR - + + + + - Đối chứng Lợn 13 Phân lập - - - - - - rRT-PCR - - - - - - Lợn 14 Phân lập - - - - - - rRT-PCR - - - - - - Lợn 15 Phân lập - - - - - - rRT-PCR - - - - - -
Chú thích: N là viết tắt của từ Ngày
Kết quả thí nghiệm Bảng 3.4 cho thấy:
Lô thí nghiệm 1: Gây nhiễm cho lợn bằng chủng virus PRRS 02HY với liều 1ml 104TCID50 trên 6 lợn, bằng cả 2 phương pháp rRT-PCR và phân lập đều xác định virus PRRS xuất hiện trong máu ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm và kéo dài đến 21 ngày. Ngày 21 vẫn có virus huyết ở 100% số lợn thí nghiệm (6/6 con).
Lô thí nghiệm 2: Gây nhiễm cho lợn bằng chủng virus PRRS 05TB với liều 1ml 104TCID50 trên 6 lợn, bằng cả 2 phương pháp rRT-PCR và phân lập đều xác định virus PRRS xuất hiện trong máu ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm và kéo dài đến 15 ngày 100% số lợn thí nghiệm (6/6 con). Đến ngày 21 còn 2/6 lợn (số 9 và số 11) xác định dương tính với virus PRRS, 1/6 lợn (số 7) âm tính với virus PRRS, 3/6 lợn (số 8,10,12) xác định dương tính với virus PRRS bằng phương pháp rRT-PCR nhưng âm tính với virus PRRS khi xác định bằng phương pháp phân lập virus.
Lợn đối chứng: Không có virus huyết trong suốt thời gian theo dõi thí nghiệm (21 ngày).
ngày đạt 100% số lợn thí nghiệm (6/6 con), còn ở lô thí nghiệm 2 virus trong huyết thanh lợn xuất hiện đến 21 ngày chỉ đạt tỉ lệ đạt 33,3% số lợn thí nghiệm (2/6 con), thấp hơn 66,6% so với lô thí nghiệm số 1.
3.1.5. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB
Nghiên cứu được tiếp tục thực hiện trên 2 chủng virus PRRS 02HY và 05TB để chọn chủng virus có tính kháng nguyên cao sử dụng làm giống chế tạo vaccine. Tính kháng nguyên được đánh giá bằng đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể trên 2 lô lợn thí nghiệm ở 5 tuần tuổi, mỗi lô 5 con sau khi gây nhiễm bằng 2 chủng virus 02HY và 05TB với liều 1ml 104TCID50/lợn. Lô lợn đối chứng là 3 lợn không gây nhiễm virus PRRS.
Sau 28 ngày gây nhiễm tiến hành lấy máu lợn, thu huyết thanh để kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng IPMA.
Để kết quả phản ứng IPMA chính xác, việc xác định lượng kháng nguyên virus gây nhiễm tế bào Marc 145 tối ưu trong phương pháp IPMA rất quan trọng. Vì thế, cần có lượng virus kháng nguyên ổn định, gây bệnh tích tế bào (CPE) và xác định được thời điểm tối ưu để tiến hành phản ứng miễn dịch. Virus dùng để gây nhiễm là chủng virus PRRS VN07196 Việt Nam có độc lực ổn định đã được chuẩn độ bằng cách pha loãng hỗn dịch virus từ 100->800TCID50 và sự phát triển CPE trên tế bào 1 lớp Marc 145 được đánh giá bằng cách quan sát thảm tế bào dưới kich hiển vi soi ngược. Liều virus gây nhiễm phù hợp là 500TCTD50/1ml. Tế bào đã nhiễm virus được cố định bằng dung dịch PBS có 10% formalin và 1% NP40 sau khi gây nhiễm 72 giờ. Thời điểm này được xác định là tối ưu để thực hiện phản ứng IPMA (Phương pháp IPMA được tối ưu và chuẩn hóa tại Phòng thí nghiệm Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương). Phương pháp IPMA được áp dụng trong thí nghiệm này và các thí nghiệm về định lượng kháng thể kháng virus PRRS trong luận án.
Kết quả so sánh tính sinh miễn dịch của 2 chủng virus 02HY và 05TB, sau thí nghiệm thu được số liệu tổng hợp ở Bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hàm lượng kháng thể trong huyết thanh lợn được gây nhiễm bằng chủng virus 02 HY và 05 TB Lô thí nghiệm Số lợn Hiệu giá kháng thể (X-1 ) Lô thí nghiệm Số lợn Hiệu giá kháng thể (X-1 ) Lô 1 (chủng 02HY) 1 5.120 Lô 2 (chủng 05TB) 1 1.280 2 5.120 2 640 3 2.560 3 640 4 2.560 4 640 5 5.120 5 640 Hiệu giá kháng thể trung bình 3.620,386 Hiệu giá kháng thể trung bình 735,17 Lô đối chứng 1 0 2 0 3 0
Kết quả nghiên cứu cho thấy, lô lợn đối chứng không gây nhiễm virus PRRS không có kháng thể kháng virus PRRS trong máu lợn và có sự khác nhau về khả năng sinh miễn dịch khi xác định hiệu giá kháng thể có trong huyết thanh lợn gây nhiễm virus PRRS giữa chủng virus 02HY và 05TB, cụ thể như sau:
Chủng 02HY gây miễn dịch trên 05 lợn trong đó 5/5 lợn kiểm tra huyết thanh có hiệu giá kháng thể từ 1/2.560 đến 1/5.120, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 1/3.620,386.
Trong khi đó chủng 05TB gây miễn dịch trên 05 lợn kiểm tra huyết thanh có hiệu giá kháng thể từ 1/640 đến 1/1.280, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 1/735,17. Nghiên cứu thực nghiệm đã xác định được chủng virus 02HY có khả năng gây miễn dịch tạo kháng thể kháng virus PRRS trên lợn cao hơn nhiều so với chủng 05TB, hiệu giá kháng thể trung bình chủng 02HY là 1/3.620,386, hiệu giá kháng thể trung bình chủng 05TB là 1/735,17. Chủng virus PRRS 02HY thể hiện tính kháng nguyên cao nên khả năng kích thích sinh miễn dịch ở lợn cao hơn nhiều so với chủng virus 05TB đây là tiêu chí rất quan trọng để lựa chọn chủng virus PRRS làm chủng độc lực để tạo giống gốc cho sản xuất vaccine PRRS. Kết quả kiểm tra độc lực virus