Để tạo chủng virus PRRS nhược độc làm giống gốc sản xuất vaccine PRRS nhược độc, chủng PRRS 02HY độc lực được cấy truyền liên tiếp 80 đời trên môi trường tế bào Marc 145, sau từng giai đoạn cấy truyền, tiến hành các nghiên cứu để kiểm tra các đặc tính sinh học, xác định tính sinh miễn dịch, khả năng nhược độc và đặc tính sinh học phân tử, sự biến đổi của hệ gen của chủng PRRS 02HY sau khi nhược độc hóa.
Trong quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145, cách 10 đời cấy truyền tiến hành chuẩn độ hiệu giá virus một lần. Từ đời cấy truyền thứ 50 trở đi, cách 10 đời cấy truyền tiến hành kiểm tra tính sinh miễn dịch của chủng virus PRRS 02HY trên lợn thông qua đánh giá hàm lượng kháng thể có trong máu lợn được gây nhiễm, đồng thời kiểm tra độc lực của virus trên lợn. Kết quả quá trình tạo virus PRRS nhược độc được trình bày ở các phần dưới đây.
3.2.1. Đánh giá đặc tính nhân lên của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền trên tế bào Marc 145
Trong quá trình cấy truyền liên tiếp chủng virus PRRS 02HY trên tế bào Marc 145, sau mỗi 10 đời cấy truyền sẽ tiến hành chuẩn độ hiệu giá virus một lần để kiểm tra độ ổn định đặc tính nhân lên của virus, đánh giá thông qua chỉ số TCID50 qua chuẩn độ dịch virus thu được từ các chai nuôi. Kết quả chuẩn độ virus PRRS 02HY thể hiện dưới Bảng 3.7 và Hình 3.4.
Bảng 3.7. Hiệu giá virus PRRS 02HY sau mỗi 10 đời cấy truyền trên môi trường tế bào Marc 145 Đời cấy truyền Chai nuôi Hiệu giá virus
(10XTCID50/ml)
Hiệu giá virus trung bình (10XTCID50/ml) P1 Chai 1 4,8 4,9 ± 0,11 Chai 2 5,0 Chai 3 5,0 P10 Chai 1 5,0 5,1 ± 0,06 Chai 2 5,1 Chai 3 5,1 P20 Chai 1 5,3 5,3 ± 0,10 Chai 2 5,4 Chai 3 5,2 P30 Chai 1 5,9 5,7 ± 020 Chai 2 5,7 Chai 3 5,5 P40 Chai 1 6,2 6,3 ± 0,10 Chai 2 6,4 Chai 3 6,3 P50 Chai 1 6,5 6,5 ± 0,00
Đời cấy truyền Chai nuôi Hiệu giá virus (10XTCID50/ml)
Hiệu giá virus trung bình (10XTCID50/ml) Chai 2 6,5 Chai 3 6,5 P60 Chai 1 6,8 6,7 ± 0,17 Chai 2 6,5 Chai 3 6,8 P70 Chai 1 6,7 6,6 ± 0,10 Chai 2 6,5 Chai 3 6,6 P80 Chai 1 6,7 6,7 ± 0,10 Chai 2 6,8 Chai 3 6,6
Hình 3.4. Hiệu giá virus trung bình của PRRS 02HY sau mỗi 10 đời cấy truyền (P1-P80)
Sau quá trình cấy truyền liên tiếp trên tế bào, chủng virus 02HY thích nghi trên môi trường tế bào Marc 145 thể hiện qua sự tăng hiệu giá virus qua các đời cấy truyền, từ hiệu giá ban đầu đạt 104.9TCID50/ml sau 80 đời cấy truyền hiệu giá virus trung bình đạt 106,7TCID50/ml. Từ khoảng đời 50, chỉ số nhân lên của virus dường như tăng rất chậm hoặc không tăng, đạt giá trị cao nhất và ổn định. Virus đời 80 được nhân lên và bảo quản ở -80oC để giám định các đặc tính giống virus vaccine nhược độc.
3.2.2. Khả năng kích thích sinh kháng thể ở lợn của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền
Kết hợp với chuẩn độ hiệu giá virus, từ đời cấy truyền thứ 50, tiến hành kiểm tra khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của chủng virus PRRS 02HY trên lợn.
Gây nhiễm 4 lô lợn thí nghiệm (4 lợn/1 lô), lợn thí nghiệm ở 5 tuần tuổi, liều gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY ở các đời cấy truyền P50, P60, P70, P80 trên 5 lô lợn là 1ml 105TCID50/lợn. Sau 28 ngày gây nhiễm tiến hành lấy máu lợn, thu huyết thanh để kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng IPMA. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS có trong huyết thanh lợn thí nghiệm được thể hiện ở Bảng 3.8.
Bảng 3.8. Hiệu giá kháng thể kháng virus PRRS trên lợn sau gây nhiễm virus 02HY ở các đời cấy truyền
Đời virus cấy truyền Lợn thí nghiệm Hiệu giá kháng thể (X-1) Hiệu giá KTTB (X-1) P50 Lợn 1 1.280 2.560,000 Lợn 2 2.560 Lợn 3 5.120 Lợn 4 2.560 P60 Lợn 1 2.560 2.560,000 Lợn 2 2.560 Lợn 3 1.280 Lợn 4 5.120 P70 Lợn 1 2.560 3.620,386 Lợn 2 5.120 Lợn 3 5.120 Lợn 4 2.560 P80 Lợn 1 2.560 3.620,386 Lợn 2 2.560 Lợn 3 5.120 Lợn 4 5.120 Chú thích: KTTB là Kháng thể trung bình
Kết quả nghiên cứu cho thấy đặc tính kháng nguyên của chủng virus nhược độc PRRS 02HY ổn định khi được cấy truyền liên tục qua các đời cấy trên tế bào Marc 145 (Bảng 3.8), chủng virus nhược độc PRRS 02HY từ đời cấy truyền P50 đến P80 kích thích tạo kháng thể miễn dịch ổn định trên lợn. Hiệu giá kháng thể miễn dịch trên lợn ở các đời cấy truyền P50-P80 đạt trong khoảng từ 1/2.560,000 đến 1/3.620,386.
Chủng virus 02HY qua các đời cấy truyền vẫn giữ được tính kháng nguyên ổn định, tạo đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể cao trên lợn và đạt giá trị tương đương nhau khi gây nhiễm virus ở các đời cấy truyền P50, P60, P70, P80.
3.2.3. Kiểm tra độc lực của chủng virus PRRS 02HY qua các đời cấy truyền
Để đánh giá hiệu quả của quá trình nhược độc hóa chủng virus PRRS 02HY, tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng virus các đời cấy truyền: P1, P50, P60, P70, P80 để phân tích, so sánh. Mỗi đời cấy truyền virus được thử nghiệm trên 05 lợn. Sau khi gây nhiễm virus, lợn được theo dõi các chỉ tiêu: Thân nhiệt, triệu chứng lâm sàng, chỉ tiêu virus huyết.
Bảng 3.9. Thân nhiệt và triệu chứng lâm sàng của lợn gây nhiễm virus PRRS 02HY ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80
Đời virus cấy truyền Liều nhiễm TCID50/lợn Số lợn thí nghiệm Thân nhiệt trung bình của lợn (oC) Triệu chứng lâm sàng P1 105 5 41,5
Lợn sốt cao, thân nhiệt cao hơn bình thường 1- 1,5oC. Lợn bỏ ăn, mắt sưng có nhử, mí mắt tím bầm (lợn đeo kính), thở khó, 2/5 lợn có triệu chứng tiêu chảy, 3/5 lợn có hiện tượng tím tai vào ngày thứ 4-5 sau gây nhiễm virus
P50 106 5
39,5 Lợn chỉ có biểu hiện sốt nhẹ (cao hơn thân nhiệt bình thường 0,5oC
P60 106 5
P70 106 5 Bình thường (39)
Không có hiện tượng lợn sốt và biểu hiện lâm sàng bất lợi
P80 106 5
Kết quả sau khi thử độc lực của virus đời cấy truyền virus: P1, P50, P60, P70, P80 (Bảng 3.9) cho thấy:
Về thân nhiệt: Sau khi gây nhiễm virus, tiến hành đo thân nhiệt của lợn trong 7 ngày liên tục, mỗi ngày đo 2 lần sáng chiều. Theo dõi cho thấy khi lợn được gây nhiễm với virus đời P1 với liều tiêm 105TCID50 thấp hơn so với liều tiêm các lô còn lại nhưng lợn có biểu hiện sốt cao kéo dài 2-3 ngày liên tục, thân nhiệt lợn sốt cao hơn bình thường 1-1,5oC, 2/5 lợn có triệu chứng tiêu chảy, 3/5 lợn có hiện tượng tím tai vào ngày thứ 4-5 sau khi tiêm virus. Trong khi các lợn được gây nhiễm virus ở các đời cấy truyền P50 và P60 liều tiêm 106TCID50 cao hơn nhưng lợn chỉ có biểu hiện sốt nhẹ (cao hơn thân nhiệt bình thường 0,5oC), không có biểu hiện lâm sàng bất lợi. Với những lợn gây nhiễm virus ở đời cấy truyền P70 và P80 không quan sát (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
được hiện tượng lợn sốt. Điều này chứng tỏ độc lực của virus đời P1 rất cao, sau khi cấy truyền liên tiếp virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảm độc lực rất nhiều chỉ còn gây sốt nhẹ cho lợn, và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đã giảm độc lực hoàn toàn gần như không có hiện tượng lợn sốt và không gây biểu hiện bệnh lý PRRS trên lợn.
Về chỉ tiêu virus huyết: Sau khi gây nhiễm virus, tất cả các lợn được lấy máu ở các thời điểm 3, 6, 9, 12, 15 ngày để phân lập virus huyết. Kết quả phân lập virus huyết được thể hiện qua Bảng 3.10 và Hình 3.5 như sau:
Bảng 3.10. Phân lập virus từ huyết thanh lợn đã gây nhiễm virus ở các đời cấy truyền
Virus đời cấy truyền
Liều gây nhiễm TCID50/lợn
Tỷ lệ lợn dương tính với virus PRRS tại các thời điểm phân lập
Lợn thí nghiệm N3 N6 N9 N12 N15 P1 105 5 5/5 5/5 5/5 5/5 3/5 P50 106 5 5/5 5/5 3/5 1/5 0/5 P60 106 5 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 P70 106 5 5/5 3/5 1/5 0/5 0/5 P80 106 5 5/5 3/5 1/5 0/5 0/5 Đối chứng 0 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Chú thích: N là kí hiệu của Ngày
Hình 3.5. Phân lập virus từ huyết thanh lợn đã gây nhiễm với virus ở các đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80
Kết quả sau khi gây nhiễm virus đời cấy truyền P1, P50, P60, P70, P80 trên lợn thể hiện ở Bảng 3.10 và Hình 3.5 cho thấy:
Lợn được gây nhiễm virus đời P1 với liều tiêm 105TCID50 thấp hơn so với liều tiêm các lô còn lại nhưng kiểm tra virus huyết trên lợn từ sau gây nhiễm đến ngày thứ 12 số lợn có virus huyết là 100%, đến ngày thứ 15 số lợn có virus huyết còn cao chiếm 60% tổng số lợn lô thí nghiệm. Trong khi đó lợn được tiêm virus ở các đời cấy truyền P50 và P60 liều tiêm 106TCID50 cao hơn đời P1 nhưng lợn chỉ kéo dài virus huyết đến ngày 12 ở đời cấy truyền P50 với tỉ lệ thấp 20%, đến ngày 9 ở đời cấy truyền P60 với tỉ lệ 40%. Với những lợn tiêm virus ở đời cấy truyền P70 và P80 đến ngày thứ 6 số lợn có virus huyết đã giảm với tỉ lệ 40% và chỉ kéo dài virus huyết đến ngày 9 với tỉ lệ thấp 20%, ngày thứ 12 không còn virus huyết. Điều này chứng tỏ virus PRRS đời P1 có độc tính cao, còn nguyên độc tính của chủng virus PRRS độc lực, sau khi cấy truyền liên tiếp virus trên môi trường tế bào Marc 145 đến đời cấy truyền P50 và P60 virus đã giảm độc lực và đến đời cấy truyền P70 và P80 virus đã nhược độc hoàn toàn không còn hiện tượng virus huyết kéo dài.
Trên cơ sở kết quả nghiên cứu các đặc tính sinh học như đánh giá đặc tính nhân lên, tính sinh miễn dịch, khả năng giảm độc lực sau các giai đoạn cấy truyền. Kết quả kiểm tra thân nhiệt, triệu chứng lâm sàng, virus huyết khi gây nhiễm chủng virus PRRS 02HY sau từng giai đoạn cấy truyền cho thấy: Chủng virus 02HY đã hoàn thành quá trình cấy truyền 80 đời trên tế bào Marc 145 để nhược độc hóa, ở đời 80 virus đã nhược độc hoàn toàn và đảm bảo yêu cầu làm giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS. Tại đời cấy truyền virus thứ 80, chủng PRRS 02HY nhược độc sẽ được kiểm tra đặc tính sinh học phân tử, biến đổi về hệ gen và tính vô trùng, thuần khiết, an toàn để làm giống gốc chế tạo vaccine PRRS. Chủng virus PRRS tạo được từ quá trình nhược độc hóa chủng 02HY cường độc được ký hiệu là chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc.
3.3. Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của chủng virus Hanvet1.vn nhược độc và chủng 02HY cường độc độc và chủng 02HY cường độc
3.3.1.Khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen virus PRRS
được chuyển sang cADN. Sử dụng cADN làm sợi khuôn để khuếch đại các đoạn gen của virus PRRS bằng PCR với 15 cặp mồi đặc hiệu đã thiết kế sao cho các đoạn gen được khuếch đại có vùng chồng lên nhau để dễ dàng nối lại thành hệ gen hoàn chỉnh của chủng Hanvet1.vn nhược độc cũng như chủng 02HY cường độc. Kết quả khuếch đại 15 đoạn thuộc hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc được minh họa ở Hình 3.6.
Hình 3.6. Khuếch đại 15 đoạn gen thuộc hệ gen của chủng virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc
Chú thích: M: Marker DNA (DNA ladder Fermentase). Các đường chạy 1-15: Sản phẩm PCR với các cặp mồi
từ 1 đến 15 khuếch đại các đoạn gen thuộc hệ gen chủng hanvet1.vn nhược độc. Kích thước đoạn gen trên các đường chạy: Đoạn gen 1: 1124 bp; Đoạn gen 2: 1244 bp; Đoạn gen 3: 1217 bp; Đoạn gen 4: 1105 bp; Đoạn gen 5: 1031 bp; Đoạn gen 6: 1041 bp; Đoạn gen 7: 896 bp; Đoạn gen 8: 1238 bp; Đoạn gen 9: 1093 bp; Đoạn gen 10: 1189 bp; Đoạn gen 11: 1115 bp; Đoạn gen 12: 1164 bp; Đoạn gen 13: 955 bp; Đoạn gen 14: 1267 bp; Đoạn gen 15: 1472 bp
Nghiên cứu cho thấy, các đoạn gen được khuếch đại đặc hiệu, trên điện di đồ chỉ xuất hiện một băng duy nhất tương ứng với mỗi đoạn gen được khuếch đại, có kích thước phù hợp với dự tính theo lý thuyết.
3.3.2. Tách dòng các đoạn gen khuếch đại
Để dễ dàng cho việc lưu giữ và giải trình tự gen, sau khi tinh sạch, sản phẩm PCR được gắn vào vector tách dòng pCR2.1, biến nạp vào tế bào E.coli chủng Top
F’. Các plasmid tái tổ hợp mang các đoạn gen khuếch đại từ hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc được sàng lọc và kiểm tra bằng cắt với enzyme hạn chế EcoRI. Đoạn gen từ plasmid tái tổ hợp sẽ được tách ra khỏi vector với kích thước tương đương sản phẩm PCR đã được gắn vào vector tách dòng. Kết quả kiểm tra các plasmid mang các đoạn gen tái tổ hợp của chủng Hanvet1.vn nhược độc được phản ánh ở Hình 3.7.
Hình 3.7. Sản phẩm cắt các plasmid với enzyme hạn chế EcoRI
Chú thích: M: Marker DNA (DNA ladder Fermentase). Kích thước vector: 3.900 bp. Các đường chạy: 1:
Plasmid gắn đoạn gen 1; 2-3: Plasmid gắn đoạn gen 2 (kích thước đoạn gen lần lượt: 680 bp và 564 bp) ; 4-5: Plasmid gắn đoạn gen 3; 6: Plasmid gắn đoạn gen 4; 7: Plasmid gắn đoạn gen 5; 8-9: Plasmid gắn đoạn gen 6; 10: Plasmid gắn đoạn gen 7; 11: Plasmid gắn đoạn gen 8 (kích thước đoạn gen lần lượt: 687 bp và 551 bp); 12: Plasmid gắn đoạn gen 9; 13: Plasmid gắn đoạn gen 10; 14-15: Plasmid gắn đoạn gen 11; 16-17: Plasmid gắn đoạn gen 12; 18: Plasmid gắn đoạn gen 13; 19: Plasmid gắn đoạn gen 14; 20-21: Plasmid gắn đoạn gen 15
Kết quả trên Hình 3.7 cho thấy, các dòng plasmid đều mang đoạn gen ngoại lai, thể hiện trên bản điện di tạo thành 2 băng rõ rệt, có kích thước tương ứng kích thước của vector và đoạn gen được chèn vào. Tuy nhiên, plasmid ở đường chạy 2, 3 và 11 lại tạo thành 3 đoạn, 1 đoạn có kích thước của vector, 2 đoạn có kích thước khác nhau không tương ứng với kích thước của đoạn gen chèn vào. Điều này có thể giải thích trong đoạn gen chèn vào có vị trí cắt của enzyme EcoRI, vì vậy đoạn gen bị cắt thành hai mảnh nhỏ. Điều này sẽ được kiểm chứng sau khi giải trình tự và phân tích gen.
3.3.3. Kết quả giải mã, phân tích hệ gen chủng Hanvet1.vn nhược độc và 02HY cường độc
Các dòng ADN plasmid được tinh sạch và giải trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động (ABI 3100). Dữ liệu kết quả được xử lý và phân tích bằng phần mềm BioEdit, PC/Gene và GenDoc. Sau khi giải mã, lắp ráp và phân tích, thu được hệ gen của chủng Hanvet1.vn nhược độc có kích thước 15.276 bp, với 3306 A, 4036 C, 3995 G và 3939 T, tỷ lệ A+T chiếm 47,42%, G+C chiếm 52,68%.
Phần không dịch mã đầu 5’ có độ dài 185 nucleotide (1-185), phần không dịch mã đầu 3’ có độ dài 110 nucleotide (15167-15276). Trình tự gen được đăng ký trên ngân hàng Genbank với mã số KU842720 (Bảng PL 3.1).
Sau khi dịch mã, toàn bộ hệ gen chủng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc có 8 khung đọc, mã hóa cho 8 protein: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khung đọc ORF1a có độ dài 7422 nucleotide (186-7607) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1a với độ dài 2473 axit amin.
Khung đọc ORF1b có độ dài 4380 nucleotide (7598-11977) mã hóa cho protein không cấu trúc NSP1b có độ dài 1459 axit amin.
Khung đọc ORF2 có độ dài 771 nucleotide (11979-12749) mã hóa cho protein GP2 có độ dài 256 axit amin.
Khung đọc ORF3 có độ dài 765 nucleotide (12602-13366) mã hóa cho protein GP3 có độ dài 254 axit amin.
Khung đọc ORF4 có độ dài 534 nucleotide (13147-13683) mã hóa cho protein GP4 có độ dài 178 axit amin.