4.3. Về đánh giá giống gốc Hanvet1.vn nhược độc sử dụng cho chế tạo vaccine PRRS vaccine PRRS
Virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc sau quá trình nghiên cứu kiểm tra đảm bảo yêu cầu giống gốc về tính kháng nguyên cao, tính tương đồng gen, kháng nguyên với virus gây bệnh đang lưu hành, tính ổn định, phát triển thích nghi trên trên tế bào dòng Marc 145. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá virus giống gốc về tính thuần khiết (không nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, virus ngoại lai khác ngoài virus
PRRS), an toàn khi gây nhiễm virus PRRS cường độc cho ít nhất 5 đời lợn liên tiếp.
Theo đó, nghiên cứu tối ưu các điều kiện nuôi cấy, liều gây nhiễm virus trên tế bào Marc 145, thời gian thu hoạch virus để có năng suất cao khi nhân giống chế tạo vaccine PRRS và điều kiện bảo quản giống gốc.
Giống gốc Hanvet1.vn cũng được đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch bảo hộ trên lợn thông qua khảo nghiệm đánh giá hiệu lực vaccine Hanvet1.vn nhược
độc (Vaccine được chế tạo từ giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn) tiêm phòng PRRS trên lợn nuôi tại một số trang trại tại Hưng Yên, Bắc Ninh và Hòa Bình. Một số kết quả đạt được như sau:
Về chỉ tiêu thuần khiết (Bảng 3.13; Hình 3.12) cho thấy giống virus PRRS nhược độc không bị tạp nhiễm vi khuẩn, nấm mốc, đạt chỉ tiêu vô trùng. Kết quả kiểm tra virus ngoại lai để xác định sự tạp nhiễm với một số virus, vi khuẩn gây bệnh ở lợn thường có triệu chứng và bệnh tích tương tự, dễ nhầm lẫn với PRRS là: Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Classical swine fever virus (CSFV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Porcine parvovirus (PPV). Kết quả nghiên cứu giống gốc Hanvet1.vn không tạp nhiễm virus ngoại lai, chỉ tiêu về tính thuần khiết của giống đạt yêu cầu giống gốc theo tiêu chuẩn TCVN 8684:2011.
Đánh giá độ an toàn của giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc trên lợn (Bảng 3.15; Bảng 3.16) cho thấy giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc không gây các triệu chứng lâm sàng, rất an toàn đối với lợn, khả năng tăng trọng trung bình của lợn sau khi tiêm giữa các lô thí nghiệm và lô đối chứng không tiêm, lợn đều phát triển bình thường. Mức tăng trọng tương đương nhau từ 4,125 kg đến 4,250 kg (Kể cả khi được tiêm với liều virus cao gấp 20 lần liều sử dụng thông thường đối
với liều vaccine PRRS nhược độc theo tiêu chuẩn TCVN 8685-12:2014) và phù hợp
với kết quả của Yu et al., 2015 khi tạo vaccine nhược độc JXA1 từ chủng độc lực cao ở Trung quốc sau 82 đời cấy truyền (passage).
Đánh giá tính kích thích tạo đáp ứng miễn dịch ở lợn của giống gốc Hanvet1.vn nhược độc, đây là một trong những chỉ tiêu cơ bản của giống virus cho chế tạo vaccine. Khả năng sinh kháng thể (Bảng 3.17) có thể nhận thấy ở liều miễn dịch 103TCID50 và 104TCID50 hiệu giá kháng thể trung bình thấp, ở liều miễn dịch 105TCID50 đến 2x106TCID50 cho hiệu giá kháng thể cao, trung bình đạt từ 1/3.620,386 đến 1/4.305,389. Như vậy ở liều miễn dịch 105TCID50/lợn, kháng thể miễn dịch tạo ra ở mức cao và ổn định, lợn không có biểu hiện bệnh lý mắc PRRS về triệu chứng lâm sàng và mức độ nhiễm virus huyết. Kết quả nghiên cứu có sự tương đồng với nghiên cứu của Leng et al., 2012 và Yu et al., 2015 khi nghiên cứu về virus vaccine PRRS nhược độc.
Một đặc trưng của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là virus huyết. Virus huyết có thể xác định bằng phân lập có giá trị về bệnh sinh và truyền nhiễm, cũng có thể xác định bằng phương pháp sinh học phân tử rRT-PCR có giá trị xác định sự hiện diện của virus, thậm chí là dấu vết của virus còn tồn dư. Theo dõi cả hai chỉ tiêu để đánh giá virus huyết, là cơ sở cho nhận xét về tính bảo hộ của vaccine nhược độc chế tạo từ giống gốc virus Hanvet1.vn nhược độc. Các lô lợn gây miễn dịch bằng giống gốc Hanvet1.vn nhược độc (Bảng 3.18) không phân lập được virus, kết quả giám định virus bằng rRT-PCR còn rải rác dấu vết virus. Trong khi đó lợn đối chứng có virus huyết cao đến thời điểm 21 ngày sau khi công cường độc, kết quả có sự tương đồng với nghiên cứu của Leng et al., 2012 và Yu et al., 2015.
Kiểm tra tính ổn định, thích ứng của giống virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc trên tế bào dòng Marc 145. Kết quả (Bảng 3.19; Hình 3.13), các đời cấy truyền virus, quá trình phát triển và gây bệnh tích tế bào (CPE) đều ổn định, thời gian thu dịch virus ở 96 giờ, hiệu giá đạt 106,33TCID50/ml đến 106,70TCID50/ml.
Tính an toàn giống gốc được kiểm tra khi gây nhiễm trên lợn và tiếp truyền qua 5 đời lợn (Bảng 3.20 và 3.21). Kết quả cho thấy toàn bộ lợn được tiếp truyền qua các đời đều khỏe mạnh, phát triển bình thường, không ốm, không có những triệu chứng bệnh lý của mắc PRRS. Như vậy, giống gốc Hanvet1.vn nhược độc đảm bảo an toàn đối với lợn và không có nguy cơ cường độc trở lại.
Để lựa chọn loại môi trường nuôi cấy tối ưu nhất cho sự phát triển của thảm tế bào Marc 145 cũng như môi trường duy trì sự sinh trưởng ổn định tạo điều kiện tối ưu cho quá trình gây nhiễm và nhân lên của virus để đạt hiệu giá virus cao nhất khi thu hoạch. Nghiên cứu tối ưu các điều kiện (Bảng 3.22; 3.23; 3.24; 3.25) cho thấy đã lựa chọn điều kiện tối ưu môi trường nuôi cấy tế bào là môi trường MEM có bổ sung thêm 0,03% Glutamine, 0,3% TPB với 5% huyết thanh bào thai bê (FBS). Môi trường duy trì tế bào khi gây nhiễm là môi trường MEM có bổ sung thêm 0,03% Glutamine, 0,3% TPB và bổ sung 1% huyết thanh bào thai bê ở mức pH 7,2-7,4 là thích hợp nhất (Alan
et al,.1999), hiệu giá virus thu được đạt cao nhất 106,7TCID50/ml.
Đồ thị sinh trưởng và phát triển của virus (Bảng 3.26; 3.27, Hình 3.14; 3.15; 316) cho thấy liều gây nhiễm thích hợp giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược
độc là 0,1MOI (1TCID50/10 tế bào) và thời điểm thu hoạch virus tốt nhất 96 giờ sau gây nhiễm, hiệu giá virus đạt 106,5TCID50/ml.
Với mục tiêu bảo quản để giữ giống trong thời gian dài vẫn đảm bảo được các đặc tính của giống. Nghiên cứu thử nghiệm hai phương pháp bảo quản ở dạng tươi trong điều kiện nhiệt độ lạnh -80oC và đông khô để giữ giống. Kết quả (Bảng 3.28; 3.29) điều kiện bảo quản giống gốc (Master seed) thích hợp nhất là ở dạng đông khô 2oC -8oC sẽ ổn định giống trong thời gian dài 24 tháng.
Qua khảo nghiệm hiệu quả vaccine nhược độc chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn tiêm phòng cho lợn tại một số trang trại, đánh giá về sự hình thành đáp ứng miễn dịch và độ dài miễn dịch thông qua xác định hiệu giá kháng thể IPMA và phản ứng trung hòa trên tế bào (Bảng 3.30; Hình 3.17). Có khác biệt về thời điểm xuất hiện kháng thể xác định bằng IPMA và kháng thể trung hòa virus sau khi tiêm vaccine. Kháng thể đặc hiệu được xác định bằng phản ứng IPMA xuất hiện từ rất sớm, từ tuần đầu tiên và đạt đỉnh ở tuần thứ 5 (1/3.880,23). Trong khi đó, sự xuất hiện của kháng thể trung hòa muộn hơn ở tuần thứ 4 và đạt hiệu giá cao nhất tuần thứ 11 ở ngưỡng 1/21,11 và bảo hộ lợn trong 6 tháng.
Đánh giá hiệu quả bảo hộ của vaccine khi thử thách với virus VN07196 cường độc cho thấy: Sau khi công cường độc, 100% lợn ở lô đối chứng không tiêm phòng đều xuất hiện các triệu chứng của lợn mắc PRRS, lô được tiêm phòng lợn khỏe mạnh, bình thường (Hình 3.18). Ở lợn đối chứng, hiện tượng virus huyết ở lợn xảy ra 100% (Bảng 3.31). Virus huyết xuất hiện sớm, đạt 104TCID50/ml tại 5 ngày sau công cường độc rồi giảm dần và đến ngày thứ 14 không còn phân lập được virus. Ở lợn tiêm vaccine không phân lập được virus huyết. Kết quả trên đã khẳng định thêm về khả năng ngăn chặn hiện tượng virus huyết của vaccine PRRS nhược độc sản xuất từ chủng Hanvet1.vn.
Theo Lopez et al., 2004, hiệu giá kháng thể trung hòa trong máu lợn phải đạt mức 1/8 mới có khả năng ngăn cản hiện tượng virus huyết khi công cường độc cho lợn. Tuy nhiên trong nghiên cứu này, chỉ với hiệu giá kháng thể trung hòa trung bình ở mức 1/1,19, tất cả lợn đã tiêm vaccine được bảo hộ và không bị virus huyết. Kết quả tương đồng với nghiên cứu của (Yu et al., 2015) về tính an toàn và hiệu
quả của chủng virus vaccine nhược độc JXA1-R, nhưng lại có sự khác biệt với nghiên cứu của (Lopez và Osorio, 2004; Lopezet al., 2007).
Về trọng lượng lợn được tiêm và không tiêm vaccine sau khi công cường độc (Bảng 3.16) cho thấy có sự khác biệt rõ rệt sau công cường độc 21 ngày, lợn tiêm vaccine được bảo hộ hoàn toàn với virus cường độc nên vẫn khỏe mạnh, không bị virus huyết, tăng cân bình thường, khối lượng so với ban đầu đạt 72,23%. Lợn không tiêm có các biểu hiện bệnh lý rất trầm trọng như sốt cao kéo dài liên tiếp 3 ngày, ủ rũ, bỏ ăn, xuất huyết dưới da, virus huyết xuất hiện và kéo dài đến 14 ngày sau khi công cường độc. Các biểu hiện bệnh lý này làm cho lợn sinh trưởng rất kém, thậm chí có lợn còn bị giảm cân sau 21 ngày theo dõi. Bệnh tích phổi đặc trưng màu đỏ xám, mặt cắt lồi và khô, hạch lympho phổi xuất huyết (Hình 3.19). Kết quả nghiên cứu có sự tương đồng với nghiên cứu của Leng et al., 2012; Yu et al., 2015 khi nghiên cứu tính an toàn và hiệu quả của virus vaccine PRRS nhược độc TJM và JXA1-R.Tuy nhiên, về thời gian bảo hộ trên lợn của vaccine PRRS nhược độc TJM chỉ đạt 4 tháng thấp hơn so với vaccine Hanvet1.vn nhược độc đạt 6 tháng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Đã nghiên cứu đánh giá độc lực và chọn được chủng virus PRRS 02HY cường độc gây triệu trứng lâm sàng, bệnh tích đại thể, vi thể, virus huyết kéo dài, điển hình, đặc trưng của lợn mắc PRRS do PRRSV. Virus 02HY thích ứng, phát triển ổn định trên môi trường tế bào dòng Marc 145, hiệu giá virus là 106,63TCID50, khả năng kích thích miễn dịch sinh kháng thể ở lợn cao đạt 1/3.620,386. Chủng 02HY cường độc đạt yêu cầu làm ứng viên tạo giống gốc virus vaccine PRRS.
2. Giống gốc Hanvet1.vn nhược độc tạo được sau 80 đời cấy truyền tiếp virus 02HY trên tế bào Marc 15 được phân tích, đánh giá về các đặc tính sinh học, sinh học phân tử đáp ứng chỉ tiêu giống gốc cho chế tạo vaccine PRRS. Hệ gen của Hanvet1.vn nhược độc (mã số trên Genbank KU842720) khi phân tích so sánh với chủng 02HY cường độc ban đầu (số đăng Genbank Submission 2490633) có 89 đột biến nucleotide và 51 đột biến axit amin nằm rải rác trong 7 gen và 7 protein tương ứng. Các gen có biến đổi làm chủng Hanvet1.vn thành nhược độc nhưng gen mã hóa protein kháng nguyên quan trọng GP5 kích thích miễn dịch sinh kháng thể trung hòa không thay đổi tính kháng nguyên. Trình tự gen ORF5 và protein GP5 chủng Hanvet1.vn nhược độc có tương đồng cao từ 94% - 99% so với 29 chủng virus PRRS thu nhận từ hơn 20 tỉnh thành trong nước và khu vực, điều này có ý nghĩa quan trọng về tính tương đồng kháng nguyên và hiệu quả bảo hộ của vaccine. 3. Giống gốc virus PRRS Hanvet1.vn nhược độc đạt tiêu chuẩn về tính thuần khiết, an toàn, tính kháng nguyên cao kích thích tạo đáp ứng miễn dịch trên lợn ở liều miễn dịch 105TCID50, hiệu giá kháng thể đạt đến 1/4.305,389, tối ưu các điều kiện nuôi cấy, liều nhiễm virus trên tế bào Marc 145 và thời gian thu hoạch virus đạt năng suất cao, hoạt lực ổn định đạt 106,5TCID50, điều kiện bảo quản giống gốc đông khô ở nhiệt độ 2-8oC, ổn định giống trong 24 tháng, vaccine PRRS chế tạo từ giống gốc Hanvet1.vn có độ dài miễn dịch bảo hộ trên lợn đến 6 tháng.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục thu thập các chủng virus PRRS lưu hành ở Việt Nam và so sánh với chủng gốc để đánh giá biến đổi di truyền của virus PRRS làm cơ sở đánh giá hiệu lực vaccine.
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
1. Nguyễn Thị Nga, Tô Long Thành, Đỗ Thị Hoa, Ngô Thị Thùy Vân (2015), Ứng dụng kỹ thuật IPMA chẩn đoán kháng thể kháng virus PRRS, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nộị: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,
31(4S): 238-245.
2. Nguyễn Thị Nga, Hà Thị Thu, Nguyễn Thị Hoa, Vũ Thị Hiền, Trần Thị Thu Hiền, Nguyễn Thanh Ba, Nguyễn Hữu Vũ, Đồng Văn Quyền, Tô Long Thành, Đinh Duy Kháng (2018). Giải trình tự và phân tích toàn bộ hệ gen chủng virus nhược độc Hanvet1.vn sử dụng trong sản xuất vaccine phòng hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 16(1): 51-57. 3. Bùi Trần Anh Đào, Nguyễn Thanh Ba, Nguyễn Thu Trang, Trần Văn Khánh,
Nguyễn Thị Ngọc, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Hữu Vũ (2019). Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm vaccine tai xanh nhược độc PRRS chủng Hanvet1.vn, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 26(1): 28-38.
4. Nguyen Thi Nga, Ha Thi Thu, Nguyen Thi Hoa, Vu Thi Hien, Nguyen Thu Trang, Nguyen Thanh Ba, Tran Van Khanh, Nguyen Huu Vu, Dong Van Quyen, To Long Thanh, Dinh Duy Khang (2022). Assessment of the genetic changes of the attenuated Hanvet1.vn strain compared with original virulent 02HY strain of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus.
THESIS SUMMARY
Research on creating attenuated PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) strain and evaluating the ability to be a virus seed for vaccine production
1. Introduction
Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) has become an endemic disease in many countries around the world, including those with a developed pig industry such as France, Germany, United States of America, the Netherlands and caused huge economic losses to the pig industry. The disease is caused by a virus of the Arteriviridae family that causes the PRRS or blue-ear
disease, first detected in Europe in 1986 and then in North America in 1987 (Benfield
et al. , 1992). The disease is classified as a dangerous disease in the list of important
diseases of the World Organization for Animal Health (OIE). In Vietnam, from 2007 to 2010, PRRS was complicated, broke out into an epidemic and continued to be scattered in a number of localities throughout the country in the following years. PRRS in pigs causes great economic losses in swine production worldwide and PRRS virus is the most common porcine respiratory pathogen in Austria.
The pig farming industry in our country is still mainly in the form of small- scale production, large-scale husbandry, and good biosecurity farming is still very limited, so disease control faces many difficulties. In order to prevent PRRS, the model of biosafety breeding and correct vaccination for pigs is an effective tool to prevent and control disease for the pig herd.
However, the PRRS vaccine mainly imported from abroad, has a high cost, and lacks initiative. Even more important is the genetic difference of virus PRRS strains isolated from different geographical areas, so vaccines made from the indigenous circulating virus strains will have the best protection for pigs in that country. The research and development of vaccines for general use in pigs in different geographical regions of the world face many difficulties (Kapur et al.,
similar clinical symptoms in pigs, but their genotypes are very different. The entire genomes of these two strains differed by up to 40% (Thiel et al., 1993). In Vietnam, it is very necessary and important to research and develop a vaccine against PRRS from the field virus strains circulating in Vietnam in order to induce a good protective immune response for pigs. Moreover, the proactive domestic production of vaccines and lower product costs will facilitate the timely vaccination and sufficient quantity of vaccines for raising pigs more easily and conveniently, helping the livestock industry to achieve economic efficiency, ensure food security and social security.
Stemming from that situation and actual needs, the research topic "Research
on creating attenuated PRRSV (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome
Virus) strain and evaluating the ability to be a virus seed for vaccine production”
has been deployed.
2. Research objectives
- Selecting PRRS virus strains isolated from PRRS-infected pigs in Vietnam and creating an attenuated PRRS virus strain by successive passage technique on Marc 145 cells.
- Evaluation of the ability to be a master seed strain of the attenuated virus PRRS strain to ensure the standards for making the original master seed for PRRS vaccine production.
- Initial assessment of the quality of vaccines produced from this original